地中海拟无枝菌酸菌专一的噬菌体ψMMR1的研究

从生产力复霉素ＳＶ的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ１１９的工业发酵罐裂解液中,分离到一株新的噬菌体ψＭＭＲ。该噬菌体经多次单斑分离、纯化,得到的噬斑多数为清亮的（约占９０％）,其它噬斑为浑浊斑,但未能从中分离到溶源菌。在被测试的可能的宿主菌中,ψＭＭＲ１不能感染除地中海拟无枝菌酸菌以外的菌株,说明寄生范围很窄。对ψＭＭＲ１的增殖和储存条件,诸如ｐＨ值、温度、二价金属离子、有机溶剂等对ψＭＭＲ１的影响进行了较     

地中海拟无枝菌酸菌U—32的3—氨基5—羟基苯甲酸合成酶（AHBAS）？…

地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２是一种临床上重要的抗生素－力复霉素ＳＶ的产生菌,研究表明,在地中海拟无枝菌酸菌的力复霉素生物合成过程中,３－氨基５－羟基苯甲酸合成酶（ＡＨＢＡＳ）是合成中间体Ｃ７Ｎ母核（又称ＡＨＢＡ）的关键酶。通过筛以广宿主粘粒ｐＬＡＦＲ３为载体构建的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２的基因文库,获得６个阳性克隆子。将含有ＡＨＢＡＳ基因的约２．５ｋｂ的片段克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ和ＫＳ     

地中海拟无枝菌酸菌U-32的3-氨基5-羟基苯甲酸合成酶(AHBAS)基因的克隆与序列分析

地中海拟无枝菌酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）Ｕ３２是一种临床上重要的抗生素———力复霉素ＳＶ的产生菌。研究表明,在地中海拟无枝菌酸菌的力复霉素生物合成过程中,３氨基５羟基苯甲酸合成酶（ＡＨＢＡＳ）是合成中间体Ｃ７Ｎ母核（又称ＡＨＢＡ）的关键酶。通过筛选以广宿主粘粒（Ｃｏｓｍｉｄ）ｐＬＡＦＲ３为载体构建的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ３２的基因文库,获得６个阳性克隆子。将含有ＡＨＢＡＳ基因的约２５ｋｂ的片段克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ和ＫＳ上,进行酶谱分析得到其在染色体上的初步定位。序列测定表明地中海拟无枝菌酸菌Ｕ３２中的ＡＨＢＡ合成酶基因,由１１６７ｂｐ组成,起始密码子为ＡＴＧ,终止密码子为ＴＧＡ,共编码３８８个氨基酸,所克隆到的ＡＨＢＡ合成酶基因在大肠杆菌的启动子控制下获得诱导表达,蛋白分子量约为４３ｋＤ。     

地中海拟无枝菌酸菌U32中amrC／amkC基因的序列分析及在大肠杆 …

从力复霉素ＳＶ产生菌－－地中海拟无枝菌酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）Ｕ３２的硝酸盐同化基因簇的上游克隆了一个２．６ｋｂ的ＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩ ＤＮＡ片段并测定其序列。序列分析表明,该ＤＮＡ片段编码两个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ）,ＯＲＦ２的起始密码子ＧＴＧ与ＯＲＦ１的终止密码子ＴＧＡ在ＴＧ处重叠。ＯＲＦ１编码一个含２２４个氨基酸的多肽,它同放线菌中典型的应答调节蛋白包     

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediteranei)U-32硝酸还原酶的定位、纯化及性质

在力复霉素ＳＶ研究中,发现硝酸盐对抗生素合成呈现多效性作用,不仅大幅度提高产量,还对产生菌——地中海拟无枝菌酸菌生理产生多方面的影响,从而提出整体性调节的结论．这一多效性作用是由硝酸盐所引起的,为此对硝酸还原酶进行了研究．首先,通过原生质体渗透裂解发现地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２的硝酸还原酶是一个胞质酶．该酶极不稳定,缓冲液中加入硝酸钾、甘油等保护剂能极大地提高其稳定性．通过硫酸鱼精蛋白沉淀,硫酸铵分级分离,Ｐｈｅｎｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、Ｂｉｏ－ＧｅｌＡ１．５ｍＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析等多步纯化得到了电泳纯的硝酸还原酶．该酶为一７９ｋＤ的单亚基酶,每分子酶含有约２．２９原子的钼,但并不含有非血红素铁、酸不稳定硫、ＦＭＮ及ＦＡＤ,其等电点为６．２,反应最适ｐＨ为７．２,最适温度为４０℃．对硝酸根的Ｋｍ值为１３．３μｍｏｌ／Ｌ．同时分析了该酶的吸收光谱．     

地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆

outhern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌u－32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的Pst Ⅰ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体上一个相同的Pst Ⅰ片段杂交,位于这一片段上的2．1kb sma Ⅰ—EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5,0kb Pst Ⅰ DNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-3z的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1．5kb左右,进一步的杂交分析发现在5．0kb的Pstl片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJLl进行了限制酶酶谱的构建。发现有10种酶在pJLl外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoR Ⅰ与Sma Ⅰ各有两个切点。     

噬菌体对黏质沙雷菌感染 BA LB／c小鼠的保护作用

本文旨在观察噬菌体对黏质沙雷菌感染小鼠的治疗作用,为噬菌体疗法应用于细菌性感染提供依据。以黏质沙雷菌为宿主菌,采用双层琼脂噬斑法从污水中分离和纯化裂解性噬菌体。将最小致死量的黏质沙雷菌经腹腔感染BALB／c小鼠后,立即腹腔注射不同剂量的噬菌体,观察动物的生存率并确定噬菌体的保护剂量。在动物感染后的不同时间（0、20、40、60和180 min ）观察噬菌体疗法对动物存活率的影响。将噬菌体和细菌同时或分别注射动物后,分析噬菌体在动物体内的药代动力学。结果显示,经噬斑法从污水中分离出1株裂解性噬菌体（命名为φSM9‐3Y ）,电镜观察发现该噬菌体属有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。动物腹腔感染黏质沙雷菌并立即给予噬菌体后发现,当噬菌体的保护剂量为108 PFU／ml时,动物的存活率为100％。动物感染后40和60 min给予噬菌体（1010 PFU／ml）治疗,动物的存活率为60％。药代动力学表明,将噬菌体和细菌同时注入动物体内,在6 h内噬菌体的滴度维持在1010 PFU／ml。结果提示,噬菌体对黏质沙雷菌所致动物腹腔内感染的治疗是有效的,提示针对细菌性感染的噬菌体疗法具有潜在的应用价值。     

一株感染铜绿假单胞菌的双链RNA噬菌体PaP6的分离和鉴定

【目的】鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP6的生物学特性。【方法】利用铜绿假单胞菌临床分离株PA038为宿主,从西南医院污水中分离得到一株裂解性噬菌体PaP6,观察其噬斑特点;氯化铯密度梯度离心纯化噬菌体颗粒后,用透射电子显微镜观察噬菌体形态;提取PaP6基因组,通过DNA酶和RNA酶酶切,做基因组酶切图谱分析;按照感染复数(MOI)分别为10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1加入噬菌体和宿主菌,裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体和宿主菌,绘制一步生长曲线;用112株铜绿假单胞菌临床分离株检测PaP6宿主谱。【结果】PaP6的噬斑直径约2 mm-4 mm,圆形透明,边缘清晰;PaP6噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约45 nm;酶切图谱表明PaP6基因组对DNase不敏感,对RNase敏感,未酶切基因组具有3节段双链RNA(dsRNA),长度分别约为9.0、4.5、3.5 kb,共约17 kb;当MOI为0.1时PaP6感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高,达到3.4×109 PFU/m L;用一步生长曲线描绘了其生长特性;PaP6可以感染40.1%的临床分离株,是一株比较广谱的噬菌体。【结论】首次报道了一株铜绿假单胞菌的ds RNA分节段噬菌体,分类学上属于囊病毒科,该噬菌体具有较广的宿主谱,在噬菌体治疗领域具有应用前景。     

地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆

Southern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌U-32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的PstⅠ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体上一个相同的PstⅠ片段杂交,位于这一片段上的2.1kb SmaⅠ-EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5.0kb PstⅠDNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-32的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1.5kb左右,进一步的杂交分析发现在5.0kb的PstⅠ片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJL1进行了限制酶酶谱的构建,发现有10种酶在pJL1外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoRⅠ与SmaⅠ各有两个切点。     

力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达

丙氨酸脱氢酶(EC1411)可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH。它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶。在地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32中,丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象,其活力受KNO3全局效应的调控。根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好,设计一对简并PCR引物。以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一555bp的片段,并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32 基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因(ald)。它编码了一个371个氨基酸的蛋白质,基因的GC含量为72.5％,符合链霉菌的基因结构特征。在起始密码子的上游6个碱基处,有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS)：AGGAGG,第75位的氨基酸为赖氨酸,是丙酮酸结合位点。以pET28b为载体,在E.coli BL21(DE3)中高效表达了ald基因。用IPTG在22℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高。用HisTag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶。酶学性质研究表明该酶专一性以LAla和NAD(H)为底物。     

噬菌体ΦEc-SL25对大肠埃希菌临床分离株裂解作用的研究

目的分离鉴定大肠埃希菌噬菌体并分析其裂解特性,为噬菌体疗法应用于大肠埃希菌感染提供实验依据。方法采用双层琼脂噬斑法从污水中分离噬菌体,通过透射电镜观察噬菌体的形态学特征,利用限制性酶切图谱初步分析噬菌体的基因组,测定噬菌体对宿主菌的最佳感染复数和一步生长曲线,分析噬菌体对宿主菌的裂解谱,观察噬菌体在不同的pH及温度下对宿主菌的裂解特性,SDS-PAGE分析噬菌体的主要和次要蛋白。结果通过噬斑法从污水中分离出1株能裂解大肠埃希菌的噬菌体,命名为ΦEc-SL25;电镜显示,噬菌体ΦEc-SL25的形态特征符合有尾病毒目、管尾病毒科噬菌体;ΦEc-SL25的最佳感染复数为0.01;一步生长曲线表明,噬菌体ΦEc-SL25的潜伏期为5 min,爆发期为10 min;ΦEc-SL25对26株大肠埃希菌的裂解率可达30.8%;在温度70℃20min时以及在pH 4~10的范围内,噬菌体ΦEc-SL25仍保持其裂解活性;蛋白电泳可观察到2条主要蛋白带和至少3条次要蛋白。结论噬菌体ΦEc-SL25是一种潜伏期短、裂解较性强的毒性噬菌体,可用于开发针对大肠埃希菌感染的生物制剂。     

利福霉素生产菌产生钝化RifSV物质的分离及性质研究

利福霉素ＳＶ（简称ＲｉｆＳＶ）生产菌──地中海拟无枝菌酸菌在生物合成ＲｉｆＳＶ过程中,产生一种能钝化自身产物（ＲｉｆＳＶ）的物质．实验证实,该物质是由谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸及缬氨酸等１４种常见氨基酸组成的蛋白质．分子量（ＭＷ）约２．５×１０４Ｄ,等电点（ＰＩ）为５．７—６．１．在１００℃下加热１０ｍｉｎ,其活性丧失．作用于ＲｉｆＳＶ的最适ｐＨ值范围为７．４—８．６,最适温度为２９℃,初步证实该物质是一种酶（暂称利福霉素钝化酶）     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的分离与鉴定

[目的]鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的生物学特性.[方法]双层琼脂培养法制备PaP4的单个噬斑,观察噬斑特点;用聚乙二醇8000浓缩PaP4颗粒后,再用氯化铯密度梯度离心纯化;用透射电子显微镜观察磷钨酸负染色的PaP4颗粒;提取PaP4基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,充分裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌,进行一步生长实验,绘制一步生长曲线.[结果]PaP4的噬斑直径约3 mm-5 mm,圆形透明边缘清晰;PaP4噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约50 nm,有一个约30 nm的短尾;限制性酶切实验表明PaP4基因组为双链DNA;当MOI为0.001时PaP4感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;用一步生长曲线描绘了其生长特性.[结论]PaP4属dsDNA短尾科裂解性噬菌体;最佳感染复数是0.001;由一步生长曲线得出感染宿主菌的潜伏期是25 min,裂解期是20 min,平均裂解量是150.     

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌K1005抗噬菌体菌株的选育

从２－酮基－Ｄ－葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌Ｋ１００５的异学发酵液中分离到两种噬菌体,分别将其命名为ＫＳ５０２和ＫＳ５０３。电镜观察表明ＫＳ５０２呈微球形,直径为６１ｎｍ;ＫＳ５０３呈蝌蚪形,具有直径为６８ｎｍ的六角形头部及８５ｎｍ长的尾部。利用紫外线诱变的方法,经多次分离筛选,获得了２株抗性稳定且产酸水平超过对照敏感菌的抗噬菌体菌株,可以应用于生产。     

一株福氏志贺氏菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

【背景】志贺氏菌是一类能引起人和动物腹泻的致病菌,由于抗生素滥用导致其耐药问题日益严重,寻找新的抗菌药物和治疗方法成为目前亟待解决的问题。【目的】检测志贺氏菌对肉鸡的致病性,分离纯化出一株可裂解强致病性志贺氏菌的噬菌体,并对其生物学特性进行研究。【方法】从病鸡肠道黏膜分离志贺氏菌;以健康肉鸡为动物模型进行攻毒,测定强致病性菌株的耐药性;并以此为宿主菌分离噬菌体,聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)沉淀法纯化浓缩噬菌体后,用透射电子显微镜观察其形态特征。利用双层平板法测定噬菌体的宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线、pH和热稳定性对噬菌体活性的影响。【结果】分离得到26株志贺氏菌,分别命名为BDS1-BDS26,其中BDS8致病性最强,经鉴定属于福氏志贺氏菌,而且存在多重耐药性,灌喂后的肉鸡出现严重腹泻和血便;解剖病症主要表现为心脏肥大、肠系膜出血明显等。以BDS8为宿主菌,分离得到噬菌体ΦDS8。透射电镜结果显示噬菌体ΦDS8的头部呈二十面体形状,直径61±2 nm,尾长165±2 nm,属长尾噬菌体科。噬菌体ΦDS8在pH 4.0-10.0、50℃以下范围内能保持...     

利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统

地中海拟无枝菌酸菌U32是力复霉素SV的工业产生菌,其遗传操作一直是一个难题。在该菌株DNA高效电转化的基础上,利用同源重组的原理,建立了地中海拟无枝菌酸菌染色体的基因置换/中断系统。通过大肠杆菌重组质粒pDK110构建、转化及两步重组筛选,成功地用α淀粉酶基因（amy）取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶基因（ahbas）。第一步单交换和第二步双交换的频率分别是0.5%～0.7% 和 2%。将质粒pDK110变性后转化可显著提高重组频率,在第二步筛选双交换前对单交换重组子进行电击也能够提高其双交换重组的频率。此外,通过转化构建的两端带同源区段的线性DNA片段及一步重组筛选,我们在地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的amrD,rifO基因中间插入了阿普拉霉素抗性基因（apr）,其效率约为30～50转化子/μgDNA。     

荧光假单胞菌抗噬菌体菌株的选育

本实验从荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ—３菌株的不正常发酵液中分离到一种噬菌体,将其命名为ＰＦＡＳ。ＡＳ—３菌株能利用葡萄糖发酵产生Ｄ－异维生素Ｃ的前体物质２－酮基－Ｄ－葡萄糖酸。电镜观察表明ＰＦＡＳ噬菌体呈蝌蚪形,具有直径为６６ｎｍ的六角形头部及长１１７ｎｍ的尾部。通过紫外线诱变及自然选育两种途径,配合简便有效的初筛方法,经多次分离、纯化、复筛最终在摇并发酵试验中获得６株产量稳定地高于对照敏感菌的抗噬菌体菌株,可望用于生产。     

腾冲热海一株栖热菌裂解性噬菌体的分离及其特征

【目的】Thermus(栖热菌)属是嗜热细菌中比较古老的类群,本研究探索从腾冲热海热泉分离栖热菌噬菌体,并初步分析其特征。【方法】采用"双层平板法"从云南腾冲热海碱性热泉中分离纯化栖热菌噬菌体;对噬菌体及其宿主进行电镜形态观察,并进行噬菌体基因组限制性酶切片段多态性分析、噬菌体生理特征及蛋白组成分析。【结果】从腾冲热海热泉分离获得1株裂解性噬菌体,其宿主菌TC10通过16S rRNA基因序列分析鉴定为Thermus属菌株。此噬菌体为长尾型,头部直径67nm,尾管长837nm、宽10nm,最适感染温度为65℃-70℃,最适感染pH值为7.6,对氯仿不敏感,其形态与分离自俄罗斯勘察加半岛热泉的栖热菌噬菌体P23-45和P74-26有一定的差异,蛋白组成差异显著,为一株新的栖热菌噬菌体,命名为TTSP10(Tengchong Thermus Siphoviridae Bacteriophage)。     

表达人γ-干扰素的重组腺病毒的制备及检测

Ｅ１区缺失的腺病毒载体插入人γ－干扰素ｃＤＮＡ序列,与ｐＪＭ１７质粒通过磷权钙沉淀法共转染２９３细胞,经同源重组,共获得６个病毒噬斑,经ＰＣＲ共扩增检测证实这６个噬斑均为带有人γ－干扰素ｃＤＮＡ的重组腺病毒,受其感染的２９３细胞的上清中,都能测到γ－干扰素的活性,且社种活性可被一定稀释度的兔抗人γ－干扰素多克隆抗体所中和,其中的１号重组病毒纯化后,按不同的ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｏｆｉｎｆｅｃｉｏ