菘蓝CYP83B1基因的克隆与表达分析

对菘蓝（Isatis indigotica Fort.）CYP83B1基因进行了克隆与表达模式分析。结果显示,IiCYP83B1基因全长为1652 bp,包含2个外显子和1个内含子;cDNA全长为1500 bp,编码499个氨基酸。IiCYP83B1编码的蛋白没有跨膜结构域和信号肽,主要定位于内质网膜,属于亲水性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲螺旋和α-螺旋组成,与萝卜（Raphanus sativus Linn.）、欧洲油菜（Brassica napus L.）、甘蓝（Brassica oleracea L.）和芜菁（Brassica rapa L.）等植物的CYP83B1蛋白具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果表明,IiCYP83B1基因在菘蓝的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;在幼苗期、生长期和花期稳定表达且均显著高于萌芽期;茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和葡萄糖（glucose,Glu）能够显著促进该基因的表达,而低温（4℃）和水杨酸（salicylic acid,SA）处理对其表达具有一定的抑制效应。本研究结果可为进一步探讨IiCYP83B1基因的功能提供参考。     

菘蓝MYB34基因的克隆及其表达分析

该研究以菘蓝新鲜嫩叶为材料,采用RT-PCR方法,克隆了菘蓝IiMYB34基因(GenBank登录号为MF373610),并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明:(1)IiMYB34基因组DNA全长为1 854bp,包含3个外显子和2个内含子;ORF全长为951bp,编码316个氨基酸;IiMYB34蛋白二级结构中无规则卷曲和α-螺旋所占比例最多,延伸链较少,与其三级结构的预测结果相一致;IiMYB34基因序列还存在2个保守的MYB DNA-binding结构域,属于典型的R2R3-MYB蛋白;IiMYB34氨基酸序列与欧洲油菜、甘蓝等植物的亲缘关系较近。(2)qRT-PCR分析显示,IiMYB34基因呈组织特异性表达,并在叶中表达量最高;茉莉酸甲酯、水杨酸及葡萄糖均显著诱导该基因的表达,而低温(4℃)和机械伤害处理对其表达具有一定的抑制效应。该研究结果为进一步揭示IiMYB34基因的功能奠定了基础。     

菘蓝APX基因克隆及序列分析

为进一步研究菘蓝APX基因的功能,构建了菘蓝APX基因真核表达载体。从菘蓝植株中提取总RNA,逆转录为cDNA,根据APX基因在该类植物中的同源性设计简并引物,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与T载体连接,PCR检测阳性克隆,同时菌液送往测序公司进行测序。结果表明:测序片段的生物信息学分析证实了该序列与GenBank登录的APX基因一致。说明成功构建了菘蓝APX重组质粒和克隆鉴定了菘蓝APX基因,可进一步用于基因表达和表达产物的功能研究。     

菘蓝铁型超氧化物歧化酶基因IiFeSOD的克隆与胁迫表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内超氧阴离子自由基的清除剂,可有效地防止它们对生物体的损害。从菘蓝中经RT-PCR方法扩增得到SOD基因,命名为IiFeSOD,其全长882 bp,包含一个834 bp的ORF,编码277个氨基酸,分析其编码的蛋白质序列显示其属于铁型超氧化物歧化酶,具有线粒体导肽,定位于线粒体中。实时荧光定量PCR技术分析结果表明,IiFeSOD在菘蓝各个组织中均有表达,但表达量高低不同,在叶中表达最高、茎次之、根中最低; 该基因受盐胁迫的诱导,随着盐胁迫强度的加强基因表达量迅速升高而后下降。同时SOD酶活性在盐胁迫处理下表现出类似的变化规律。说明SOD的大量积累与植物的耐逆性密切相关。     

猪CuZnSOD基因的克隆、表达及功能分析

为了进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能,揭示CuZnSOD对猪抗氧化机能的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记,文章采用RACE(Rapid amplification of cDNA end)方法,对莱芜猪CuZnSOD基因cDNA进行克隆测序,分析其结构和功能,并用Real-timePCR检测CuZnSOD基因的表达.结果表明,CuZnSOD基因cDNA序列全长658 bp(GenBank登录号:GU944822),包含76 bp的5'UTR和120 bp的3'UTR序列.全部CDS序列462 bp,编码153个氨基酸,分子量为15.9 kDa,等电点为6.03.CuZnSOD基因编码的氨基酸序列中,第3氨基酸残基处存在1个O-糖基化位点,第86氨基酸残基处存在1个N-糖基化位点.二级结构中α螺旋仅占1.31%.在进化过程中高度保守,与人、牛、小鼠和褐鼠的编码区同源性分别为87.74%、87.66%、83.44%和83.23%;氨基酸序列同源性分别为90.26%、94.12%、92.21%和91.50%.CuZnSOD存在典型的金属结合配体结构域(GFHVHQFGDNT).基于蛋白序列所构建的分子进化树表明猪与牛的亲缘关系最近.在mRNA水平上,CuZnSOD是一个广谱表达基因,在大脑、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓,肌肉、背膘和胃中都能检测到,其在肾脏,小肠和肺中表达量较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低.     

菘蓝IiCYP79F1基因的克隆与表达分析

该研究以菘蓝叶片为材料,采用RT PCR方法克隆菘蓝IiCYP79F1基因,并对其进行生物信息学与表达模式分析。结果表明：（1）成功获得IiCYP79F1基因的gDNA全长（2 109 bp）,包含3个外显子及2个内含子,ORF全长为1 626 bp,编码541个氨基酸（GenBank登录号为KY774689.1）;生物信息学分析显示,IiCYP79F1蛋白的二级结构主要由α 螺旋（43.81%）、无规则卷曲（35.49%）、延伸链（13.68%）和β 转角（7.02%）组成;其氨基酸序列与西兰花、欧洲油菜、芜菁和芝麻菜的相似性较高,其蛋白与芝麻菜的亲缘关系最近。（2）qRT PCR分析显示,IiCYP79F1基因呈时空特异性表达,且在茎中与幼苗期高表达;MeJA、Ag⁺、葡萄糖和机械损伤处理均能有效促进IiCYP79F1基因的表达,而SA和低温处理则具有明显的抑制作用。该研究结果为进一步探讨IiCYP79F1在菘蓝芥子油苷生物合成中的作用奠定了基础,也为培育高芥子油苷含量的菘蓝新种质提供了新思路。     

菘蓝IiLEA基因的克隆及胁迫表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白),是指胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质,大量研究表明这些蛋白质的积累与渗透胁迫耐受性密切相关.该实验以250 mmol/L NaCl溶液处理9 h的菘蓝幼苗为材料,经RT-PCR方法扩增得到LEA基因,命名为IiLEA.经测序确认该基因含有648 bp的开放阅读框,编码由215个氨基酸组成的亲水性蛋白质.对培养30 d的菘蓝无菌幼苗进行自然干旱处理和盐胁迫处理,Northern杂交结果显示,正常生长条件下,IiLEA基因在菘蓝幼苗体内不表达,随着胁迫时间的延长其表达量逐渐增加,到9 h时表达量达到峰值,干旱处理和盐处理有相似结果,表明该基因可能受逆境胁迫诱导表达.     

中华鳖STING基因的克隆及功能分析

为了研究干扰素基因刺激因子STING在中华鳖(Pelodiscus sinensis)先天免疫中的作用, 克隆了中华鳖STING基因(PsSTING)的cDNA序列, 其全长为2145 bp, 包含1152 bp的开放阅读框, 编码383个氨基酸。氨基酸序列比对发现, PsSTING蛋白N端含有4个跨膜区和2个RXR内质网滞留基序, C端有1个解旋酶结构域。qRT-PCR结果显示, PsSTING在中华鳖心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、胃、皮肤、肌肉和血细胞等组织中均能表达, 其中在脾脏中的表达量最高, 其次是肝脏、小肠和肺, 而在血细胞中的表达量最低; 用嗜水气单胞菌、LPS和poly(I:C)刺激后, PsSTING基因呈现出先上调后下调的趋势, 在刺激12h 时显著高于对照组(P＜0.05), 24h达到最高值, 在48h后逐渐恢复到初始水平, 其蛋白表达量在脾脏和小肠中明显增加。体内RNA干扰后, 小肠中PsSTING的表达量显著下调(P＜0.05), IFN信号通路中TBK1、IRF3、IRF7、STAT6和IFN-β等基因表达水平显著下调(P＜0.05)。在HEK293T细胞中过表达PsSTING基因, 能够显著激活pIFN-β-luc的启动子。研究结果表明PsSTING基因参与调控了中华鳖的先天免疫反应。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制.因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达.我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837 bp的拖牵丝蛋白基因(ASP),并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN.pASG在大肠杆菌中16℃下24 h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48 h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达.本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试.     

ＥＳＴ在克隆新基因中的应用

随着基因定位（连锁图谱、物理图谱、转录图谱）和ＤＮＡ测序及生物信息技术的迅猛发展,ＥＳＴ已成为人类寻找新的未知基因以及克隆不同时空差异表达基因和疾病相关基因的重要标志物。随着ＥＳＴ数据库的进一步完善,网上克隆和定位候选克隆策略将成为克隆新基因的主要方法,并在虚拟的网上空间将模型生物基因组的研究成果成功地应用于人类基因组的研究中。     

菘蓝二倍体及其同源四倍体遗传差异的ISSR分析

以1个菘蓝二倍体及其10个同源四倍体株系为材料,利用19个随机扩增ISSR引物分析其遗传差异性,为菘蓝多倍体诱变的基因表达调控以及遗传改良提供依据。结果显示:菘蓝二倍体与其同源四倍体及四倍体之间的ISSR多态性有明显差异,除主要遗传位点相同外,有些四倍体株系扩增条带数多于二倍体,有些四倍体株系扩增条带数少于二倍体,四倍体株系间亦有多态位点;11个株系共扩增111条多态性条带,多态性达55.22%。聚类分析显示,不同四倍体株系与二倍体的遗传差异大小亦不同。研究表明,菘蓝二倍体与其同源四倍体具有中等偏高的遗传差异性。     

氮素形态及配比对5个种源菘蓝的生物碱类成分和多糖的影响

以5份不同种源的菘蓝为材料,采用田间小区试验,设置不施氮(CK)、硝态氮(NO3--N)、铵态氮(NH4+-N)、NH4+-N/NO3--N=75/25、NH4+-N/NO3--N=50/50、NH4+-N/NO3--N=25/75和酰胺态氮等7个处理,分析比较了不同种源植株的靛蓝、靛玉红和总生物碱含量、(R,S)-告依春及多糖含量等指标的差异,为菘蓝栽培生产中氮素的高效利用提供理论参考。结果表明:氮素处理有利于提高山西运城菘蓝和陕西商洛菘蓝叶内靛蓝含量,以及安徽亳州菘蓝和陕西商洛菘蓝叶内的总生物碱含量;NH4+-N/NO3--N=50/50处理对山西运城菘蓝,以及酰胺态氮处理对山西运城菘蓝和陕西商洛菘蓝叶内生物碱类成分的积累均有促进作用;与对照相比,氮素处理亦能有效地提高甘肃张掖菘蓝和陕西商洛菘蓝根内的(R,S)-告依春及安徽亳州菘蓝根内的多糖含量;安徽阜阳菘蓝(R,S)-告依春含量在任一氮处理下均远远高于其他种质菘蓝。研究表明,不同种源菘蓝对氮素处理的响应存在较大的差异,建议生产中综合考虑菘蓝的来源和需肥规律,采用经济有效的施氮组合,以提高其活性成分含量。     

夏播菘蓝不同居群干物质和活性成分积累特征

为研究夏播菘蓝不同栽培居群的最佳采收期,以来自于山西、安徽、甘肃、江苏和河南的5个栽培居群为材料,设置盆栽土培实验,于菘蓝生长第60天起,间隔10d采样,共采集6次样品,采用HPLC法测定其叶片、叶柄、根茎和根4个部位的靛蓝与靛玉红含量。结果表明:(1)不同栽培居群随着生长时间的延长,其叶片、叶柄、根茎及根的生物量持续增加,其中来自于山西居群的生长最佳,干物质积累量最大。(2)不同居群叶片及叶柄内靛蓝与靛玉红含量最大值出现在生长90~100d,即为叶内活性成分积累的高峰期。(3)综合分析其活性成分与干物质的积累量,各居群叶片靛蓝积累量最大值在生长90~100d,叶片、叶柄与根茎的靛玉红积累量也出现在90~100d。若以中国药典的靛玉红为质量控制指标,同时综合考察其生物量指标与活性成分积累量指标,夏季播种的来自于山西、安徽和河南的菘蓝居群最佳采收期为生长100d左右,而来自于甘肃与江苏居群的则以生长90d最佳。     

氮素营养对苗期菘蓝叶中硝酸还原酶活性与矿质元素吸收的影响

采用正交试验设计,研究铵态氮、硝态氮和酰胺态氮3种氮素形态及其不同浓度配比对苗期菘蓝的单株干重、叶内的硝酸还原酶活性及矿质元素吸收的影响。结果显示:(1)影响苗期菘蓝单株干重的氮素形态依次为酰胺态氮>铵态氮>硝态氮。(2)不同氮素形态对叶片硝酸还原酶活性影响有差异,铵态氮影响最大,其次是硝态氮和酰胺态氮。(3)不同形态氮素配合施用后均能促进P、K、Ca、Mg、Cd、Mn、Cr、Sr 8种元素的吸收,但不利于Ni和Fe的吸收;元素吸收受铵态氮影响最大的矿质元素有K、Ba、Se、Ni、B、Si、Fe 7种元素,受硝态氮影响最大的元素有P、Cd、Ti、Al、Cu 5种元素,受酰胺态氮影响最大的元素有Na、Ca、Mg、Zn、Mo、Mn、Cr、Sr 8种元素。研究表明,不同形态氮素对苗期菘蓝吸收矿质元素的影响存在很大的差异,应注重酰胺态氮与无机的铵态氮、硝态氮的配合施用;适宜氮素形态及其配比能提高叶中硝酸还原酶的活性并促进矿质元素的吸收,从而有效地促进菘蓝的生长。     

缺氮和复氮对菘蓝幼苗生长及氮代谢的影响

对基质育苗后水培的菘蓝进行缺氮与复氮处理,分析其生长情况及氮代谢产物含量的变化,探讨缺氮和复氮对菘蓝幼苗生长及氮代谢的影响,以提高菘蓝产量和品质以及栽培过程中的氮素利用效率。结果显示:(1)正常供氮条件下,菘蓝幼苗的叶绿素含量、谷氨酰胺合成酶(GS)活性、硝态氮含量、靛玉红含量为最高,而其株高、主根直径、根的鲜重与干重、叶的鲜重与干重、根系活力均最小。(2)缺氮处理增加了菘蓝幼苗的主根直径和根干重,提高其根系活力和硝酸还原酶(NR)活性,促进游离氨基酸在叶中的积累;但降低了GS的活性,也降低了叶中硝态氮、可溶性蛋白、靛玉红及根中游离氨基酸的含量;缺氮对叶中靛蓝的含量无明显影响。(3)复氮处理增加了菘蓝幼苗的株高、主根长、根鲜重、叶鲜重、叶干重,提高了其根系活力,降低了NR和GS的活性;与对照相比,复氮降低了叶中硝态氮含量,提高了叶中可溶性蛋白、靛蓝及根中游离氨基酸的含量,但对叶中游离氨基酸和靛玉红含量影响较小。研究表明,缺氮后再复氮有利于菘蓝幼苗叶的生长,同时有利于增加其叶内靛蓝含量,从而提高其产量和品质。     

Smoke-water improves shoot growth and indigo accumulation in shoots of Isatis indigotica seedlings

Although smoke treatments have successfully been used for promoting the germination of many seeds, there are no reports on the effect of smoke on secondary metabolite production in plants. This study highlights the effects of smoke-water on shoot growth and accumulation of indigo in shoots of Isatis indigotica Fort., a Chinese medicinal plant. Results showed that seedlings treated with smoke-water at a dilution of 1:1000 achieved the highest fresh and dry shoot mass, which was significantly (P < 0.05) different from the control and other smoke-water dilutions tested. A higher concentration of smoke-water (1:500) significantly increased (P < 0.05) the indigo concentration in shoots compared with untreated seedlings. The effect of 1:1000 and 1:2000 dilutions gave non-significant increases in the concentration of indigo. These findings suggest the possible use of smoke-water for promoting the growth and accumulation of secondary metabolites in plants.     

外源5-氨基乙酰丙酸对盐胁迫下菘蓝种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响

采用砂培方式,研究了外源5-氨基乙酰丙酸(ALA)对盐胁迫下菘蓝种子的萌发、幼苗叶片的可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量及其抗氧化酶活性的影响,探讨ALA缓解菘蓝受盐胁迫伤害的响应机制。结果显示:(1)菘蓝种子萌发及幼苗生长在100 mmol·L^-1 NaCl胁迫下受到明显的抑制,种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数与自然含水量均显著降低,丙二醛含量、可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性显著升高。(2)盐胁迫下适宜浓度的ALA处理显著提高了种子萌发率、自然含水量及SOD、POD和CAT活性,降低了可溶性糖和丙二醛的含量,并以16.7 mg·L^-1 ALA处理盐胁迫下菘蓝种子的发芽率、发芽势最大,其幼苗的SOD、POD、CAT活性最强。研究表明,盐胁迫显著抑制菘蓝种子的萌发及幼苗生长,适宜浓度的ALA能够有效缓解盐胁迫对菘蓝种子萌发及幼苗生长的伤害,提高植株的抗盐性,并以16.7 mg·L^-1 ALA处理效果最佳。