微生物学方法制备16α-甲基-11α，17α，21-三羟基孕甾-1，4-二烯3，20-二酮

本文报道了简单节杆菌A69-2和球孢白僵菌AS69同时存在下对16α-甲基-17α-羟基孕甾-4．烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(16MRSA)的协周转化作用。 这种协同转化怍用既能解除16α-甲基-11α,17a,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮(16MllaHC)对球孢白僵菌AS69的11α羟化酶的抑制作用,又可降低高浓度的16M11aHC对节杆菌A69—2脱氢酶活性的影响,同时还能抑制节杆菌脱氢过程的副反应。在底物浓度为0.15％(W／V)时,l6α-甲基-11α,17a,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(16MDHC)的收率约50%,故是制备1 6MDHC的一种理想的微生物学方法。     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α，17α，21 三羟基孕甾-1，4 二烯 3，20 二酮

选育到一株对16β-甲基-17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力。在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认。     

A环饱和甾体的微生物转化作用I．用17a-甲基表雄醇制备去氢17a-甲基睾丸素

本文比较了诺卡氏菌(Nocardia)和节杆菌(Arthrobacter)两属共62株菌株对17a-甲基表雄醇(1)和17a-甲基睾丸紊(III)的脱氢能力,以找出生产去氢17a-甲基睾丸素(IV)的菌种。根据这些微生物的脱氢特点,它们的转化作用可以分以下四种类型：(1)I→III→IV (2)I→III→IV (3)I→III→IV (4)I→III→IV 从第二种转化类型的微生物中选到一株能彻底氧化(I)的节杆菌9—2。在它的培养基质中加硫酸钻可抑制去氢1 7扣甲基睾丸素(IV)的降解,从而使产物(IV)大量积累。脱氢的最适pH为6,溶解甾体底物用的乙醇浓度为2％。在此条件下,去氢17a-甲基睾丸素(IV)的转化率超过85％。     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮

选育到一株对16β-甲基,17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21-乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力.在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,11α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认.     

制备16a-甲基孕甾1，4，9(11)一三烯的微生物学方法

17a,21一二羟基-16a-甲基孕甾-4,9(11)-二3,20一二酮-21-醋酸醌(I)与节杆菌A69-2培养物中,出现较大量结晶物,经分离和鉴定,确认为17a,21一二羟基一16a-甲基孕甾-1,4,9(11)一三烯-3,20一二酮(III)。结晶母液中还残存少量17a,21-二羟基卅16a-甲基孕甾-4,9(11)-二烯一3,20-二酮(IV)和化合物(I)和(I)的简单脱氢类似物(II),提出了合成(III)的可能途径．     

微生物转化雄甾-4-烯-3，17-双酮的菌种筛选和转化条件的初步研究

雄甾-4-烯-3,17-双酮(简称4AD)是甾体药物的重要中间产物,其11α羟化产物可制成治疗心血管疾病的药物。通过对30株不同种属真菌转化4AD能力的筛选,获得球孢白僵菌(Beauveria bassiana)QY2A对4AD有高效C11α羟化能力,得到目标产物C11α-羟基雄甾-3,17-双酮(简称11α-OH-4AD)。另对该菌株的转化条件进行优化,结果表明:初始pH值6.0,温度28℃,转速180r/min,转化时间60h,助溶剂甲醇终浓度和底物浓度分别为2.5%和2.5g/L时,11α-OH-4AD的转化率为65%,比未优化的转化率提高了51.2%。     

雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)转化菌种的筛选及鉴定

从土壤中筛选能将植物甾醇转化为雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)的菌种。采用富集培养基富集能降解植物甾醇的菌种、采用摇瓶进行发酵、采用薄层层析的方法对发酵产物进行检测、采用高效液相方法测定发酵液中4-AD的含量、采用PCR方法扩增菌种的16S rDNA序列。筛选出了一株转化能力最强的菌株,命名为:3-12。将这株菌的16S rDNA序列与GeneBank中收载的序列进行比对,3-12号菌株为分支杆菌。     

总状毛霉对4-烯-3-酮甾体的生物转化研究

从土样中筛选到一株能转化甾体的菌株,经形态观察,鉴定为总状毛霉(Mucor racemosus)。首次利用该菌株对4-烯-3-酮类甾体衍生物进行生物转化,目的是合成具有潜在活性的羟基类4-烯-3-酮衍生物。转化条件为27℃,220r/min振荡培养4d。转化产物经乙酸乙酯萃取,用硅胶柱层析法分离,通过红外、质谱和核磁分析确定了甾体转化产物的化学结构。黄体酮生物转化得到的产物是14α-羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮和7α,14α-二羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮;4-雄烯二酮的转化产物是14α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮1、4α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮和6α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮。研究结果表明总状毛霉具有转化甾体的能力,对4-烯-3-酮类甾体进行生物转化的主要产物是14α-羟基甾体衍生物。     

制备13β-乙基-3-甲氧基-8，14-开链-1，3，5(10)，9(11)-雌四烯-17β-醇-14-酮的微生物学研究

调查了10属酵母共104株形成一种光学活性的13β-乙基-3-甲氧基-8,14-开链-1,3,5(10),9(11)一雌四烯-17β-醇-14-酮的能力。发现酵母属酵母具较强的活性。啤酒酵母AS2.346是一株最好的菌,它能使底物几乎全部转化成产物。用这株菌研究了酵母细胞的培养和转化条件。在发酵过程中,观察到了“假结晶发酵”现象。在最适条件下,[葡萄糖4—4.5％和玉米浆2—2.5％,微酸性条件下培养的幼龄酵母细胞,转化pH中性,31屯并通气,乙醇浓度不高于3％(体积／体积)。]产物收率达85—90％。     

Mycobacterium sp．高效转化植物甾醇为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的诱变选育

采用紫外线、亚硝基胍复合诱变雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）的转化产生菌Mycobacterium sp．,结合平板筛选,获得一株遗传性状稳定单产ADD的突变菌株Mycobacterium sp．-11,其ADD质量浓度达到1246ms／L,比原始菌株（484mg／L）提高了150％,经初步优化后发酵液中ADD最高达到1430mg／L,发酵液中ADD质量占ADD、AD两产物质量总和的比例由70％提高到99．1％。     

节杆菌82菌株降解胆甾醇生成3-氧代-联原胆烷一1，4-二烯-22-酸

从19株有降解胆甾醇能力的微生物中,筛选出一株节秆菌(Arithrobacter)82菌株,它能在含硫酸钴的培养基中转化胆甾醇和积累3-氧代-联原胆烷-1,4-二烯-22酸(BNc)。转化过程中形成的主要中间体为胆甾烯酮(Cholestenone)。降低培养基中葡萄糖的浓度并增加玉米浆的量,可促进胆甾烯酮侧链的降解,有利于BNC的积累。BNC可在酸性溶液中形成结晶并沉淀下来,故适宜于离心收集。用传统的理化方法及光谱分析技术测定了产物的结构及特性。     

一株高产胞外壳聚糖酶的优良新菌株

经过对1,000多株细菌和真菌的筛选,获得一株直生顶孢霉(Acremonium strictum)菌株F-480,抗生素诱变后,选育出一株高产胞外壳聚糖酶的优良突变菌株CH-208,通过最适碳源、氮源、诱导物、微量元素,通气量以及培养起始pH的考察,用正交试验方法,对培养基组成和培养条件进行优化,酶活力比原菌株提高了1倍。     

A环饱和甾体的微生物转化作用III．倍他美松中间体16β-甲基-5a-△9(11)-孕甾烯-3β,17a, 21-三羟基一20一酮一21一醋酸酯的△1.4 作用

节杆菌9—2在一定浓度的氯化钻存在下转化16β一甲基一5a一△9(11)一孕甾烯-3β,17a,21-三羟基一20一酮21-醋酸酯(I)为16β-甲基-A1.4,9(11)-孕甾三烯-17a,21一二羟基-3,20-二酮(n)。转化的最适条件为氯化钴浓度0．08％;乙醇2一4％;pH 7—8;温度28—30℃。在此条件下,产物(II)的收率在60％以上。     

黑曲霉催化雄甾-4-烯-3,17-二酮16β-羟基化

为进一步确定黑曲霉菌株TCCC41650的生物转化能力,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androstenedione)为底物,利用黑曲霉菌株TCCC41650进行催化,产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为16β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。转化条件为:培养液pH 6.0,乙醇添加量为2%,投料浓度为1‰时,72 h转化率为85.8%。目前甾体研究领域对于C16β-羟基化的微生物转化未见报道,研究结果为C16β-羟基甾体药物的研发奠定了基础。     

分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素C_(1,2)位脱氢反应的研究

9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅳ)是生产9-氟甾体激素的关键前体,以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Ⅰ)为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法,发现分枝杆菌全细胞只能将Ⅰ转化为9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮(Ⅱ),而细胞裂解液可以有效地将Ⅰ转化为Ⅳ,其反应机制为底物Ⅰ自发水解为中间体Ⅱ,Ⅱ在C_(1,2)位脱氢酶(KSTD)的催化作用下发生C_(1,2)位脱氢反应生成产物Ⅳ。为进一步提高产物Ⅳ的转化率,利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码KSTD的关键基因:kst D、kst D3和kstD_M,提高脱氢反应效率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.0的重组菌株MS136-kst D_M细胞裂解液中反应45h,Ⅳ的转化率为78.4%,比出发菌株提高了38.9%;并优化缓冲液pH,提高反应速率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.5的重组菌株MS136-kstD_M细胞裂解液中反应45 h,Ⅳ的转化率为92.8%,比出发菌株提高了63.4%。     

新金色分枝杆菌ksdD基因的敲除及其对菌株AD(D)合成的影响

新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3,17-二酮(AD)和1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮(ADD),其中3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)是AD转化为ADD的关键酶.本实验室在筛菌过程中筛选到一株能将甾醇转化为AD(D)的菌株,经鉴定为M.neo...     

梨头霉11α—羟基化制备16β—甲基—11α,17α21—三烃基孕甾—1, …

选育到一株对１６β－甲基－１７α,２１－二羟基孕甾－１,４＝－二烯－３,２０－二酮（Ⅱａ）１１α－羟基化活性强的梨头霉Ａ２８菌株,并发现底物２１－乙酰化（Ⅱｂ）可明显提高１１α－羟工 能力。在适宜的转化条件下,１１ｂ投料浓度０．５％,产物１６β－基１１α,１７α,２１－三羟基孕甾－１,４－二烯－３,２０－二酮（Ⅲ）收率为７３％,结构经波谱分析确认。     

酶法一步生产葡萄糖酸-δ-内酯的研究

从全国各地采集到的400多份土壤和谷物样品中分离到501株黑曲霉菌株,经筛选后得一株葡萄糖氧化酶活力较高的黑曲霉Y19菌株,以该菌株为出发菌株,经UV、γ-射线及硫酸二乙酯(DES)等诱变筛选后,获得一株酶活较出发菌株高15倍多的黑曲霉UCD 69菌株。通过正交试验确定了几个影响菌体生长和产葡萄糖氧化酶的主要因素水平,并选出了该菌的最适培养条件。用上述条件培养出的菌丝来直接发酵葡萄糖生产葡萄糖酸-δ-内酯。产品收率可达所用葡萄糖重量的50%。     

α-乙酸乳酸脱羧酶高产菌株的优化培养条件的研究

α-乙酸乳酸脱羧酶（α－acetolactatedecarboxylase,简称ALDC,EC,4．1．1．5）用于啤酒生产中,可将啤酒酵母在主发酵期间形成的α-乙酰乳酸直接转化为3-羟基丁醇,由此可大大缩短啤酒熟化期,从而提高设备利用率,增加产值．我们通过反复诱变已筛选到一株ALDC高产菌株（编号为ZIT-6-1－2）。为了进一步提高酶产量,对该菌株进行了发酵条件的优化组合研究．通过对发酵培养基组分、碳氮比、培养基起始pH值、通气量、培养温度、培养时间和微量元素等进行了一系列研究．结果表明上述诸因素对该ALDC高产菌株的酶产量均有不同程度的…     

紫外诱变菌降解菜籽饼粕中粗蛋白的实验研究

采用紫外照射法对原始菌株进行诱变和筛选,得到一株降解饼粕中粗蛋白能力较强的变异菌株UV—A,能使饼粕中粗蛋白的含量降到15．46％,是原始菌株的1．4倍。把该变异菌株接入到装有12．5kg菜籽饼粕的40L塑料箱内进行固体发酵,发现饼粕中粗蛋白的含量降解到8．9％。并通过正交设计试验确定变异菌株UV—A的培养条件为：NaCl5％,温度30℃,pH7．0,培养时间48h,其中温度对其影响最大。