乙型肝炎病毒进入肝细胞机制研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染早期进入肝细胞机制研究一直是HBV研究领域的热点和难点．简单易得的HBV体外感染细胞模型是HBV感染进入机制研究无法逾越的主要障碍．近年来,随着新型HBV体外感染细胞模型的建立和应用(HepRG细胞和树鼩原代肝细胞),HBV的进入机制研究取得了一系列重大发现．综述了近几年HBV进入肝细胞机制的最新研究进展,主要包括HBV表面蛋白进入相关结构域的鉴定,已发现的候选HBV进入相关分子和尚待解决的问题．     

HBV基因结构及体外表达的研究现状

人乙型肝炎病毒(HBV)不仅能引起人类急慢性肝炎,而且还可导致原发性肝癌的形成。然而,遗憾的是至今尚无有效的办法来防治HBV的感染。近年来,由于基因重组技术的发展,加速了HBV的研究进程,HBV的基因结构,转录及增殖特性已基本弄清,并且整合在原发性肝癌细胞染色体上的HBV DNA序列亦被证实。同时采用多种载体系统重组HBV DNA片段,在体外已成功地表达了乙型肝炎表面抗原(HBsAg),     

应用RNAi文库筛选HBV复制相关基因

深入研究HBV复制机理,筛选参与HBV复制的基因,可能为开发抗乙肝病毒新药提供新 的靶点．本文拟建立一种筛选HBV复制相关基因的方法: RNAi文库感染HepG2.2.15细胞后,利用免疫磁珠收集HBsAg表达降低的细胞,提取DNA,PCR扩增siRNA编码序列,将PCR产物克隆入T-easy载体,随机挑选克隆测序,发现DDB1基因可能参与HBV复制．本试验建立了一种筛选HBV复制相关基因的方法,为大规模全基因组筛选参与HBV复制的基因奠定了基础．     

利用基因捕获技术建立稳定表达HBV的细胞模型

pGEM-HBV1.3质粒经HindIII限制性内切酶消化,将HBV1.3全长DNA切下,与同样经HindIII限制性内切酶降解过的PU21连接,得到PU21-HBV重组质粒。将该重组质粒采用电击转染方法导入HepG2细胞中,G418筛选阳性克隆并以X-gal染色,RT-PCR、Southern blot等方法验证HBV DNA的插入和表达。 PU21-HBV重组质粒经测序证明HBV1.3全长DNA正确与PU21载体连接,该重组质粒转染HepG2细胞后经G418筛选,得到一系列阳性克隆, Southern blot证实HepG2细胞基因组中含HBV DNA,RT-PCR结果表明HBV DNA在HepG2细胞中有功能基因的转录。HBV1.3已被整合在HepG2细胞染色体中并能稳定表达其RNA。稳定的HBV表达细胞模型构建成功。HBV表达细胞模型的建立,为进一步研究相关基因对HBV的转录、复制、转录后调节以及HBV各种蛋白的表达机理研究提供实验材料。     

应用微环DNA技术体外诱导和制备重组的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础。本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA^loxP)产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型。本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2T PhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNA^attR)微环产生和纯化的策略。纯化的rcccDNA^attR微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达。与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNA^attR尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症。因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒持续感染。     

两种抽提乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的效果比较

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作为一种嗜肝DNA病毒,在感染肝细胞后会在细胞核中形成病毒转录复制的模板和基因储存库--共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA),其持续存在是乙型肝炎慢性化和难以治愈的核心,也是此研究领域内的重点。从细胞样品中稳定抽提获取cccDNA对于保证cccDNA检测的准确性至关重要。Hirt法是一种抽提真核细胞染色体外DNA的方法,被用于HBV cccDNA的抽提,但存在操作复杂和耗时长等问题。为简化操作,有研究对Hirt法进行改良,结合硅胶膜离心柱来抽提染色体外DNA,但尚不清楚该法用于HBV cccDNA抽提与传统Hirt法的效果差异。本研究基于HBV cccDNA细胞转染系统、HBV复制细胞系及感染系统,以DNA印迹(Southern blot)和定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)作为检测评价手段,平行比较了传统Hirt-酚/氯仿法与改良Hirt-过柱法抽提HBV cccDNA的效果。结果表明,两种方法具有相当的抽提效率和抽提特异性,而改良Hirt-过柱法耗时更短,提示在进行细胞HBV cccDNA抽提时可选择改良Hirt-过柱法以提高实验效率。     

化学发光法检测体外HBV复制

目的:建立化学发光法检测体外HBV复制水平的方法,研究其灵敏度和稳定性.方法:用HBV DNA重组质粒pCH9转染到人肝癌细胞株HepG2和Huh7中,5d后收集细胞并抽提其HBV复制中问体DNA,转印后以地高辛标记HBV DNA为探针进行杂交,用化学发光法检测杂交结果,同时进行探针灵敏度的检测.结果:转染后HepG2和Huh7细胞提取HBV DNA中检测出较强的复制中间体的信号,分别为松散环状DNA(rcDNA),双链线性DNA(dslDNA),单链DNA(ssDNA),探针检测的灵敏度可达到lpg,接近同位素法检测的灵敏度.整个实验重复3次获得同样结果.结论:成功建立了稳定的化学发光法检测体外HBV复制水平的方法.     

化学发光Southern blot法检测HBV体外复制及其应用于药物对HBV的抑制分析

目的：建立化学发光Southern blot检测细胞内HBV DNA的方法,同时检测3种不同靶点抗乙肝药物的体外作用。方法：用地高辛标记HBV探针,优化杂交条件,检测来自HepG2及HepG2.2.15 HBV DNA复制中间体;利用建立的化学发光Southern blot检测HBV DNA的方法检测经拉米夫定、Bay41-4109、α-Galcer以不同药物浓度处理的HepG2.2.15HBV DNA复制中间体的水平。结果：（1）标记的HBV探针的检测灵敏度为0.1pg,杂交系统的检测灵敏度为1pg,可检测到HepG2.2.15细胞内的HBV DNA特异性信号;（2）以该法检测胞内HBV DNA可见3种药物都有明显的抑制作用,其半数有效量（IC50）分别为1.53μmol/L、0.41μmol/L、0.01μmol/L。结论：胞质HBV DNA的水平能准确地反映不同靶点抗HBV药物的抗病毒效果,建议在观察药物特别是中药抗病毒研究中采用。     

基于微滴数字PCR技术建立单细胞水平研究HBV的方法

在单细胞水平研究肝组织内乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是十分重要的,但相关研究技术尚处于推进阶段,不能满足临床需要。基于微滴数字聚合酶链反应技术(digital droplet polymerase chain reaction, ddPCR),本研究建立了一套单细胞水平绝对定量HBV DNA和RNA的单细胞微滴数字PCR方法(single-cell ddPCR, sc-ddPCR)。通过混合不同比例的HBV阳性和阴性细胞来模拟HBV慢性感染状态下的肝脏,分析此方法检测HBV DNA的线性和检测下限。以cccDNA来源RNA(episome-derived RNA, eRNA)为例,进一步设计针对eRNA的sc-ddPCR检测方案。利用不同来源转录本在结构上的差异,设计针对eRNA的特异性引物探针体系,在HBV肝癌细胞系中验证此引物和探针体系的特异度,并利用梯度稀释的HBV细胞株分析此方法检测eRNA的线性和检测下限。结果显示,本研究建立了基于ddPCR的DNA和RNA的单细胞水平检测方法,该方法表现出良好的线性(HBV DNA:R²...     

乙型肝炎病毒和黄曲霉素协同作用诱发人肝细胞癌细胞株的建立

为了研究人乙型肝炎病毒（HBV）和黄曲霉素（AFB1）在肝癌发生过程中的作用,我们用HBV感染的人胚胎肝细胞移植至裸鼠背部皮下,以后每周皮下注射AFB1,在裸鼠体内成功地诱发了人肝细胞癌。选3只裸鼠所形成的肿瘤组织,分别再接种裸鼠传代。在裸鼠体内传至5代后,将瘤组织在体外培养、传代,建立了3个肝癌细胞株,分别为CBH－1a、CBH－1b和CBH－2。对3个细胞株进行生物学特性分析发现,细胞生长迅速,接触抑制消失,细胞增殖核主数Ki67阳性细胞占38．2％,用EMA单抗检测证实为人来源细胞,核酸原位杂交显示,细胞中HBV－X和HBV－S基因阳性,PCR可扩增出X基因,证明HBV基因已到瘤细胞中,3个细胞株细胞再接种裸鼠皮下,可再生成肿瘤,此实验证明了HBV协同AFB1在个肝细胞癌发生过程中的病因作用。同时,为进一步研究HBV和AFB1在肝癌发生过程中的分子机制提供了细胞水平的模型。     

HBV pre-c-Fc融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其生物学活性研究

目的:在杆状病毒表达系统中表达融合蛋白乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc蛋白(HBV precore protein-mouse IgG Fc,HBV pre-c-Fc),并鉴定其免疫原性。方法:目的基因HBV prec-Fc连接到pFastBac1载体,获得的pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒转化DH10Bac感受态,通过Tn7转座子将目的基因转座到Bacmid中,得到Bacmid-HBV pre-c-Fc穿梭载体,脂质体包被后转染Sf9昆虫细胞获得P1代病毒,重复转染Sf9获得高滴度病毒。收集细胞上清超滤后通过Protein G亲和层析柱纯化得到目的蛋白HBV pre-c-Fc。纯化的蛋白大腿内侧肌肉注射免疫BALB/c小鼠并检测血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量。结果:HBV pre-c-Fc在昆虫细胞中成功表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,蛋白产量约为3.03mg/L,纯化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠产生特异抗体。结论:成功地在杆状病毒表达系统中表达了具有免疫原性的HBV pre-c-Fc蛋白,为生产乙肝治疗性疫苗奠定了基础。     

免疫检查点分子在慢性HBV感染中对T细胞功能影响的研究进展

阻断免疫检查点分子的信号通路可以增强免疫系统功能,这在肿瘤治疗中获得了显著效果。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染的原因之一为HBV在体内通过一系列方式来减弱、抑制免疫系统的功能,从而逃避免疫识别和杀伤。HBV可以通过上调病毒特异性T细胞表面的抑制性受体来抑制T细胞活化、增殖和效应。本文总结了HBV导致的人体内T细胞上免疫检查点程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3,Tim-3)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)的异常表达以及它们影响T细胞功能的机制,揭示了免疫检查点在治疗慢性乙肝中的良好应用前景。     

反义RNA寡核苷酸及其与脂质体的复合物对于乙型肝炎病毒的抑制

我们设计合成了特异性靶向乙型肝炎病毒(HBV)mRNA的反义RNA寡核苷酸P-2987、X-60和X-519.在瞬时转染pHBV1.3质粒(含有1.3拷贝的HBV基因组)的HepG2细胞和整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞中,转染2μmol/L的反义RNA寡核苷酸,ELISA和实时定量PCR结果表明,这3条寡核苷酸可以明显抑制HBV的复制和抗原表达.在HBV转基因鼠中,尾静脉注射反义RNA寡核苷酸,结果表明,肝脏中HBV的复制得到了抑制,但是血清中抗原含量和HBV DNA拷贝数没有明显变化.反义RNA寡核苷酸X-519与脂质体的复合物可以增强其对于HBV在肝脏中复制的抑制作用.在通过高压尾静脉注射pHBV1.3质粒建立的HBV急性感染模型中,反义RNA寡核苷酸X-519可以显著地抑制HBV在肝脏中的复制以及降低血清中病毒抗原水平和DNA拷贝数.上述实验结果说明,X-519及其与脂质体的复合物对于HBV的复制和抗原表达起到明显的抑制作用,可能作为一种潜在的针对HBV的基因治疗药物.     

HBV DNA环化结构在体外的复制表达水平优于HBV线性结构的表达质粒

为了研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA环化结构与HBV线性结构的表达质粒在体外复制表达水平的差异,采用3种含有HBV全长DNA的表达质粒与自连环化的HBV DNA分别转染Huh7细胞. 5 d后收集转染处理过的Huh7细胞和细胞上清,从感染细胞中抽提纯化HBV复制中间体进行Southern印迹分析,并将细胞培养上清进行ELISA分析.结果显示,HBV DNA通过环化后转染Huh7细胞,可高效地进行转录和复制表达,且优于质粒转染的效果.证明在细胞中,HBV DNA环状结构的复制表达能力优于HBV线性结构的表达质粒.     

乙型肝炎病毒假病毒体外感染树鼩原代肝细胞模型的建立

目的：建立乙型肝炎病毒假病毒（HBVpp）体外感染树鼩原代肝细胞（PTH）模型。方法：通过肝脏原位两步灌注法分离PTH并对其冻存方法进行优化,通过共转染293T细胞生产基于慢病毒包装系统的HBVpp并考察其感染的种属和组织特异性。结果：通过肝脏原位两步灌注法分离了PTH,并优化了PTH冻存液的配方;包装的HBVpp具有与HBV真病毒类似的感染种属和组织特异性。结论：该模型的建立对深化HBV进入肝细胞机制的研究具有重要意义。     

反义RNA寡核苷酸及其与脂质体的复合物对于乙型肝炎病毒的抑制（英文）

我们设计合成了特异性靶向乙型肝炎病毒(HBV)mRNA的反义RNA寡核苷酸P-2987、X-60和X-519.在瞬时转染pHBV1.3质粒(含有1.3拷贝的HBV基因组)的HepG2细胞和整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞中,转染2μmol/L的反义RNA寡核苷酸,ELISA和实时定量PCR结果表明,这3条寡核苷酸可以明显抑制HBV的复制和抗原表达.在HBV转基因鼠中,尾静脉注射反义RNA寡核苷酸,结果表明,肝脏中HBV的复制得到了抑制,但是血清中抗原含量和HBV DNA拷贝数没有明显变化.反义RNA寡核苷酸X-519与脂质体的复合物可以增强其对于HBV在肝脏中复制的抑制作用.在通过高压尾静脉注射pHBV1.3质粒建立的HBV急性感染模型中,反义RNA寡核苷酸X-519可以显著地抑制HBV在肝脏中的复制以及降低血清中病毒抗原水平和DNA拷贝数.上述实验结果说明,X-519及其与脂质体的复合物对于HBV的复制和抗原表达起到明显的抑制作用,可能作为一种潜在的针对HBV的基因治疗药物.     

APOBEC3A通过脱氨基作用抑制HBV复制

目的:研究APOBEC3A抑制HBV复制的分子机制。方法:首先在肝癌细胞HuH7中过表达APOBEC3A,通过MTT法检测了APOBEC3A对细胞毒性的影响;通过免疫荧光检测了APOBEC3A在细胞中的定位,通过IP试验进一步证实了APOBEC3A与病毒颗粒的相互作用;并通过ELISA,特异性荧光定量PCR检测了HBV复制的参数包括上清中HBsAg,病毒核心颗粒中HBV DNA以及核内的cccDNA的表达水平;最后通过3D PCR方法分析了核心颗粒中HBV DNA脱氨基作用。结果:过表达APOBEC3A对HuH7细胞毒性没有显著性差异;APOBEC3A主要位于细胞核,但APOBEC3A可以与病毒颗粒结合,在逆转录环节对HBV复制发生抑制作用;共转染HBV复制质粒和APOBEC3A表达质粒后,细胞上清中HBsAg,核心颗粒中的HBV DNA以及核内的cccDNA均显著下降;最后通过3D PCR和克隆测序表明核心颗粒中的HBV DNA负链发生了大量的G-A突变,同时正链也发生了较多的C-T突变。结论:APOBEC3A可与病毒颗粒结合,在HBV复制的逆转录环节可作用于HBV单链,发生脱氨基作用,从而抑制HBV的复制。     

HBV影响XRN2基因在HepG2-H7细胞中表达的机制研究

目的利用稳定表达HBV的HepG2-H7细胞,研究HBV对XRN2基因表达的调控,并对其作用机制进行初步探讨。方法用RT—PCR和Real-time PCR的方法检测HepG2细胞及稳定表达HBV的HepG2-H7细胞中XRN2在mRNA水平的表达差异。构建XRN2启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞及HepG2-H7细胞,检测HBV对XRN2启动子的影响。将XRN2启动子质粒与HBV4种蛋白的真核表达质粒共转染HepG2细胞,寻找对启动子影响较大的HBV蛋白。结果RT—PCR和Real-time PCR的结果显示XRN2在HepG2-H7细胞中的表达较HepG2细胞有所下降。荧光素酶活性分析显示HBV能抑制XRN2启动子的活性,且HBx和HBp蛋白在这一过程中起主要作用。结论HBV蛋白可以通过抑制XRN2启动子活性调节其在HepG2-H7细胞中的表达。     

乙肝病毒感染对细胞基本自噬的影响

【目的】慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染在肝硬化和肝癌的发生过程中起着重要的作用,通过研究HBV感染对细胞基本自噬的影响,为HBV感染诱发肝癌以及HBV的免疫逃逸机理研究提供新的思路。【方法】本研究利用乙肝病毒表达质粒瞬时或稳定转染不同肝细胞,通过计数绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)聚集数目检测自噬小体形成,western blot检测LC3(microtubule-associated proteinlight chain 3,微管相关蛋白质轻链3)脂酰化和p62的降解,通过构建HBV B型和C型X蛋白(HBx)的表达质粒并瞬时转染肝癌细胞和正常肝细胞,对不同基因型X蛋白对细胞自噬的影响进行了分析。【结果】乙肝病毒感染后促进了LC3的脂酰化和p62的降解,增加了自噬小体的形成,增强了细胞的基本自噬。进一步研究发现,HBV感染增强的细胞基本自噬水平由HBx所引发,且C型HBx比B型对细胞基本自噬的增加更加显著。【结论】HBV通过HBx增强细胞的基本自噬,且不同基因型HBx对细胞基本自噬的增强程度不同,为进一步阐明HBV感染机理奠定了基础。     

从动物模型看乙型病毒性肝炎致病机制的研究进展

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是通过血液和体液传播的嗜肝DNA病毒,尽管有有效的预防疫苗,乙型病毒性肝炎仍是我国乃至全球人类健康的重大威胁。HBV的易感宿主只局限于人以及黑猩猩等灵长类动物,HBV感染性疾病的研究遇到很大困难。多种小动物研究模型的建立,使我们对HBV感染致病机制的认识有了很大进步,包括:分子病毒学特征、在感染细胞中生命周期、机体的抗病毒免疫反应、肝脏病变的免疫病理机制等。但是,由于已有动物模型的种种限制,我们对HBV感染及乙型肝炎发生和发展的认识还远远不够,目前除了抗病毒治疗外,还没有有效地治疗慢性乙肝的方法。建立能够真实反映临床HBV感染、乙肝发生和进展过程的纯系小鼠模型,对于我们全面深入地理解HBV感染的侵入机制、宿主和病毒之间相互作用,以及发展预防和治疗HBV感染的新方法都具有非常重要的意义。