栝楼ISSR-PCR体系的正交优化

目的：建立栝楼最佳ISSR-PCR正交优化体系,为开展栝楼ISSR分子标记奠定技术基础。方法：采用正交试验设计对影响栝楼ISSR-PCR扩增的重要参数（DNA模板、MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶）进行优化试验,同时进行不同温度梯度试验和ISSR体系筛选。结果：最佳的栝楼ISSR-PCR的反应体系（20μl）为：30ng模板DNA,2.0mmol/L MgCl2,0.3mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶;退火温度为52℃-55℃;扩增反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸7min;4℃保存。结论：建立了栝楼的最佳ISSR反应体系,为栝楼种质鉴定提供了更客观可靠     

药用植物草珊瑚RAPD扩增条件优化

采用CTAB-DNA提取方法,从草珊瑚植物的嫩叶中提取总DNA。以此DNA为模板,优化了草珊瑚RAPD-PCR的反应条件。结果表明,PCR扩增体系最适宜的条件为:反应体积25μL,内含2.5mmol/L Mg2+、1.0UDNA聚合酶、0.4μmol/L引物、60ng模板DNA和0.16mmol/L dNTP。扩增程序为:94℃预变性2min;94℃变性30s,37℃复性30s,72℃延伸80s,40个循环;72℃延伸10min;4℃保存10min。     

黑籽南瓜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

以云南个旧黑籽南瓜叶片基因组DNA为模板,固定反应程序,采用L_(16)(4~5)正交试验设计的方法,对影响ISSR-PCR反应的五因素(dNTPs,Mg~(2+),引物,Taq DNA聚合酶,模板DNA)在四个水平上进行优化试验。研究建立起了适于云南黑籽南瓜ISSR-PCR的最佳反应体系:25μl反应体系中含10×buffer 2.5μl、0.15mmol/L dNTPs、2.5mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、1.5U Taq DNA聚合酶、DNA模板15ng。扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,进行35个循环,最后72℃延伸7min。该优化体系的建立为今后用ISSR标记技术进行黑籽南瓜种质资源的分类鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。     

云生毛茛ISSR-PCR体系优化与引物筛选

旨在建立稳定可靠的云生毛茛ISSR-PCR反应体系。采用正交试验设计方法,对影响云生毛茛ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、d NTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA五个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化,建立适用于云生毛茛的最佳反应体系和扩增程序,并对反应体系和扩增程序进行验证;在此基础上筛选多态性好的ISSR引物,采用梯度法筛选各个引物的最适退火温度。结果表明,云生毛茛20μL ISSR-PCR的最佳反应体系为:模板DNA 30 ng,Mg2+1.95 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.04U/μL,d NTP 0.150 mmol/L,引物0.5μmol/L;最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性20 s,49.6-60.6℃复性1 min,72℃延伸100 s,38个循环;72℃下延伸6 min。在优化的反应体系和反应程序条件下,从100条ISSR引物中筛选获得16条ISSR扩增引物,并确定了引物各自的最适退火温度。经过不同居群云生毛茛的验证,证明优化后体系扩增条带清晰且重复性好,可用于后续云生毛茛遗传多样性的研究。     

均匀设计优化建兰ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响建兰ISSR-PCR体系的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化,建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,舍引物0．25μmol／L、Mg^2＋ 2．5mmol／L,dNTP0．2mmol／L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA40ng．在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选．筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min;接着进行32个循环：94℃变性35S,52～56℃退火45S,72℃延伸90s;循环结束后,72℃延伸10min．同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物．     

葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计L9(34)对影响葡萄ISSR-PCR反应体系的4个因素(dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA)在3个浓度水平上进行试验,并通过直观分析初步确定其反应体系;在此基础上,通过单因素试验探讨了dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA、退火温度及循环次数等因素或条件对葡萄ISSR-PCR扩增结果的影响,确定最佳反应水平。最终建立了葡萄ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:在25μL的反应体系中,dNTP浓度0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量0.5 U,引物浓度0.4mmol/L,DNA模板用量40 ng。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min 30 s,40次循环;最后72℃延伸10 min,10℃保存。     

濒危植物峨眉野连ISSR反应体系的建立与优化

针对峨眉野连ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系,为进一步研究峨眉野连的种质资源遗传多样性奠定基础。通过筛选引物并设定影响峨眉野连ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测其不同反应体系的扩增效果,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立峨眉野连ISSR-PCR稳定可靠的反应体系。首次建立了可用于峨眉野连ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25μLPCR反应体系中,内含1×PCRBuffer,1.5mmol/LMg2+,200μmol/LdNTP,0.3μmol/L引物,80ng模板,1.0UTaqDNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性5min,然后进行35个循环:94℃变性30s,(据不同引物的退火温度)复性60s,72℃延伸90s,循环结束后72℃延伸7min,4℃保存。所建立的峨眉野连ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于峨眉野连的种质资源多样性及居群鉴别的研究。     

优化蕺菜属ITS-PCR扩增条件的研究

目的:建立蕺菜rDNA ITS扩增反应的优化体系.方法:以蕺菜DNA为模板,采用单因素试验设计,对影响蕺菜rDNAITS区扩增的重要参数进行了优化试验.结果:最优蕺菜ITS-PCR的反应体系为25μl反应体系中含Tao酶0.75U、Mg2+2.5mmol/L、dNTP 0.15mmol/L、引物对0.6μmol/L、模板DNA 10ng.扩增程序为在94℃下预变性4min,然后进行36个循环(94℃变性45s,60℃退火50s,72℃延伸90s),最后在72℃延伸8min.结论:这一体系的建立为利用蕺菜rDNA ITS区研究蕺菜种质资源的系统进化提供了标准化程序.     

正交设计优化紫萼藓科植物的ISSR-PCR反应体系

目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:通过L16(45)正交试验,研究了dNTP浓度、镁离子浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响。结果:建立了紫萼藓科ISSR-PCR反应的最佳反应体系,其中dNTPs浓度为0.8mmol/L、Mg2+浓度为3.0mmol/L、模板为15ng、引物浓度为1.4μmol/L、Taq酶量2U,总体积为25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。采用引物UBC812等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步对紫萼藓进行ISSR分子标记奠定了基础。     

华顶杜鹃ISSR反应体系的优化及亲缘关系的初步分析

以华顶杜鹃为材料,利用单因素试验确立适合华顶杜鹃ISSR-PCR的优化反应体系:在25μL反应体系中,Mg2+1.5或2.0mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,引物0.40μmol/L,Taq DNA聚合酶lU,模板DNA 40ng;分析ISSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度对ISSR-PCR反应的影响。PCR扩增程序:预变性94℃ 3min;变性94℃ 45s;退火(Tm+2)℃(根据引物不同设定)75s;延伸72℃ 1.5min;40个循环;继续延伸72℃ 10min;1.5%琼脂糖电泳分离PCR产物。并以优化好的体系初步分析华顶杜鹃及5个近缘种(茶绒杜鹃、Rhododendron mayebrae、Rh.sataense、南平杜鹃和映山红)的亲缘关系,6个种明显地聚为2大类:A类含有映山红、南平杜鹃;B类含有茶绒杜鹃、Rh.sataense、Rh.mayebrae与华顶杜鹃,为明确华顶杜鹃的系统地位提供可借鉴的依据。     

狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）ISSR-PCR反应体系的建立与优化

研究目的是获得适用于狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）遗传多样性研究的ISSR—PCR反应标准化程序。通过单因素试验设计,对Mg^2＋、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板、引物浓度,以及退火温度、循环次数等影响ISSR扩增的主要因素进行了研究和优化。结果表明,UBC808、UBC811、UBC812、UBC825、UBC826、UBC841、UBC888及UBC891引物适用于该研究;20μL ISSR—PCR最适反应体系包括：6ngDNA模板、0．4μmol／L引物、2．25mmoL／LMg^2＋、0．6U Taq DNA聚合酶、0．4mmol／LdNTPs。扩增程序为：94℃预变性4min;然后94℃变性1min,48～50℃（根据不同引物确定）复性2min,72℃延伸1min,共进行40个循环;最后,72℃延伸7min,4℃保存。     

黄鳝ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

以黄鳝基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,对各反应因子、引物退火温度和循环参数进行优化.建立了黄鳝的最适ISSR-PCR反应体系,25 μl反应体系中含2.5 mmol/ L Mg2+,250 μmol/ L dNTPs,0.25 μmol/ L 引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,30 ng DNA模板.最佳反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性40 s,48～57℃复性40 s(随引物而确定),72℃延伸1.5 min,循环次数40;72℃延伸10 min.利用所建立的ISSR反应体系,获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带.     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化

目的:为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析,建立银杏ISSR-PCR的最佳扩增反应体系。方法:采用正交设计和单因素梯度实验,对影响ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTP、引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶)进行筛选及优化。结果:银杏25μL ISSR最佳扩增反应体系包含10×Taq反应缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2、0.45 mmol/L dNTP、1.2μmol/L引物(UBC861)、10 ng模板DNA及0.9 U Taq DNA聚合酶,使用此ISSR扩增反应体系,获得了10株不同性别银杏DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。结论:优化的反应体系为采用ISSR分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。     

番茄叶霉病菌ISSR-PCR体系的建立

以番茄叶霉病菌(Passalora fulva)基因组DNA为模板,采用单因素试验和正交设计试验对该菌ISSR-PCR体系中的一些重要参数(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、缓冲液、循环次数)和引物进行筛选和优化,并对退火温度进行了梯度优化,建立了番茄叶霉病菌ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,引物1.5μmol/L,模板DNA45 ng,TaqDNA聚合酶1.0 U,1倍的PCR缓冲液,循环40次,退火温度50℃。     

中国木犀科苦丁茶ISSR实验条件优化的研究

系统地研究了中国木犀科苦丁茶ISSR反应体系中的主要影响因子,建立了一套稳定的ISSR PCR反应参数。筛选出了10个有效引物,并以中国木犀科苦丁茶8个物种共21份种质材料为供试材料对优化后的反应条件的重复性、多态性进行了检测。优化后的反应体系为：10×buffer 2.5 μL,2.0~3.0 mmol·L^-1 MgCl₂,150~300 μmol·L^-1 dNTPs,Taq酶1.0~1.5 U,引物0.4~0.5 μmol·L^-1,DNA模板5~320 ng。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min,然后按94℃变性40 s,50~54℃退火45 s,72℃延伸120 s,进行35个循环,最后72℃延伸8 min。该反应条件可应用于中国木犀科苦丁茶亲缘关系和遗传多样性分析。     

珍稀植物杨叶肖槿ISSR体系建立及检测

针对珍稀植物杨叶肖槿ISSR反应的特点,建立了适用于杨叶肖槿遗传多样性研究的ISSR最适反应体系,具体包括:2.0μL 10×Buffer,27.5ng的模板DNA,2.0μL的dNTP,1U的Pyrobest DNA酶,1.25μmol/L的引物;最佳反应程序为94℃预变性5min,然后94℃变性1min,49℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。应用该优化的反应体系筛选出了10条稳定性强、清晰度高而且表现出一定多态性的ISSR引物,并对杨叶肖槿进行了检测,获得了清晰稳定的扩增图谱。     

正交设计优化北重楼ISSR-PCR体系

利用正交试验设计L₉(3⁴)的方法,最终建立了北重楼ISSR-PCR的优化反应体系,即20 μL反应体系中包含1×buffer,dNTP 175 μmol·L^-1,Primer 0.8 μmol·L^-1,Mg²⁺ 1.4 mmol·L^-1,Taq酶2.5 U及模板DNA 80 ng。适宜的扩增程序为95℃预变性5 min;94℃变性40 sec,55℃退火45 sec,72℃延伸90 sec,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该优化体系的建立,将为北重楼及其近缘种的系统学和种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。