表达淀粉酶、糖化酶葡糖酸醋杆菌工程菌的构建

采用基因融合技术,将葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter hansenii ATCC23769分泌蛋白CMCax的信号肽序列分别与来源于枯草芽胞杆菌的淀粉酶基因、黑曲霉的糖化酶基因融合构建融合蛋白,连入能在G.hansenii ATCC23769自主复制的载体pbs-H1S中,电击转入G.hansenii ATCC23769,构建能内源表达淀粉酶、糖化酶,以及淀粉酶-糖化酶的葡糖酸醋杆菌。淀粉平板透明圈检测结果和DNS测酶活结果显示,构建的3种工程菌能成功表达并分泌淀粉酶和糖化酶。     

黑曲霉S1生淀粉糖化酶生物合成的调节研究

本文对黑曲霉S_1(Aspergillus niger S_1)生淀粉糖化酶生物合成调节进行了初步研究,认为该菌生淀粉糖化酶的合成与菌体生长呈负相关,即酶的合成过程是典型的选择性合成过程。该菌生淀粉糖化酶的合成受降解物阻遏调控,缓慢供给低浓度易利用碳源和添加环腺苷磷酸(cAMP)可使酶的合成消阻遏,通过研究放线菌素C_1(Actinomycin C_1)等抑制剂对酶合成的影响而推断黑曲霉S_1生淀粉糖化酶合成的阻遏调控发生在转录水平上。     

携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究

以工业生产菌株黑曲霉CICIMF0410基因组DNA为模板,扩增出糖化酶glaA基因,测序并进行表达研究。GlaA基因的核苷酸序列长为2167bp,包含4个内含子。氨基酸序列比对表明此黑曲霉糖化酶与其他曲霉属来源的糖化酶有很高的同源性。将glaA基因克隆到pBC-Hygro载体中,构建重组质粒pBC-Hygro-glaA并转化A.nigerF0410。携多拷贝glaA的转化子用150μg/mL潮霉素抗性筛选并通过荧光实时定量PCR鉴定。结果表明,在染色体整合2~3倍糖化酶基因对糖化酶的过量合成是适宜的,有助于提高糖化酶活力。对转化子进行摇瓶发酵研究,发酵终止时转化子GB0506的糖化酶活力比出发菌株F0410提高了17.5%。因此,增加黑曲霉染色体糖化酶基因的拷贝数可以显著提高糖化酶活力。     

黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

从黑曲霉糖化酶高产株T2l合成的糖化酶cDNA,经5’端和3’端改造后克隆到酵母质粒YFDl8上,转化酿酒酵母。转化子的淀粉培养基平板检测,培养滤液蛋白电泳和糖化酶活力分析都表明,含有糖化酶基因表达质粒的酵母转化子能有效地分泌有功能的糖化酶到细胞外。实验证明酵母a园子启动子和分泌信号序列能促使黑曲霉糖化酶cDNA在酵母中表达和分泌．实验还表明．黑曲霉糖化酶原的翻译后加工序列很可能亦能被酵母识别,加工生成有功能的成熟的糖化酶。以上成功为构建有实用意义的淀粉水解酵母工程菌迈出了重要的一步。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

用黑曲霉(Aspergillusniger)G1为宿主菌表达粉红黏帚霉(Gliocladiumroseum)糖化酶。运用PCR技术从粉红粘帚霉中扩增得到一个疑似糖化酶基因序列(约1.8 kb),并将其连接到载体p Gm上组建成重组质粒p Gm-3440。将重组质粒转化到黑曲霉G1菌株中,经amd S筛选及PCR验证获得表达糖化酶的黑曲霉重组工程菌。重组菌的发酵结果显示,糖化酶基因在黑曲霉中得到了分泌表达,用国标法(QB/T 1803-1993)测得重组糖化酶活性达292 U/m L。进一步对其酶学性质进行分析发现,该重组酶最适温度和p H分别为50℃和5.0,该酶的耐热性较差,p H稳定性较好。     

携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究

以工业生产菌株黑曲霉CICIM F0410基因组DNA为模板,扩增出糖化酶glaA基因,测序并进行表达研究。GlaA基因的核苷酸序列长为2167 bp,包含4个内含子。氨基酸序列比对表明此黑曲霉糖化酶与其他曲霉属来源的糖化酶有很高的同源性。将glaA基因克隆到pBC-Hygro载体中,构建重组质粒pBC-Hygro-glaA并转化A. nigerF0410。携多拷贝glaA的转化子用150μg/mL潮霉素抗性筛选并通过荧光实时定量PCR鉴定。结果表明,在染色体整合2～3倍糖化酶基因对糖化酶的过量合成是适宜的,有助于提高糖化酶活力。对转化子进行摇瓶发酵研究,发酵终止时转化子GB0506的糖化酶活力比出发菌株F0410提高了17.5%。因此,增加黑曲霉染色体糖化酶基因的拷贝数可以显著提高糖化酶活力。     

嗜热糖化酶基因在重组黑曲霉工程菌中的表达及酶学性质初步研究

为了提高糖化酶的耐热性能,降低淀粉糖化发酵工艺的生产成本,构建了同源整合载体pEasy-glaAdir以及pEasyssg,将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因(glaA)灭活,并将硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的嗜热糖化酶基因(ssg)插入到黑曲霉基因组中,筛选得到表达嗜热糖化酶的重组黑曲霉工程菌(A.nigerWW1)。重组菌的发酵结果显示,嗜热糖化酶在黑曲霉中得到了分泌表达,发酵液酶活达到3 030 U/mL。重组嗜热糖化酶的最适反应温度为90℃,最适pH为6.0,该酶具有较高的热稳定性,在80℃时的半衰期在60 min以上,具有良好的工业应用前景。     

植物遗传工程

924546转化大麦小抱子〔会,英〕/Kasha,K.J.”·/In Vitro一1992,28(3).Pt.2一ioZA〔译自DBA,1992,11(11),92一06289〕 用微粒子枪轰击大麦(H。而“‘训乙gare)不同龄的小抱子。培养系统由固体培养基、滤纸和一种膜组成。6年或5年以下(包括新分离的)小抱子获得的结果最好。用二种质粒选择转化株,一种编码花色素昔(ant)色素,另一种含有声半乳糖昔酶(GUS)和除草荆BASTA的选择标记基因 (bar基因)。花色素昔表达的量和程度差别很大。用3 09/1 BASTA进行选择最有效。许多植株用选择培养基培养能存活6~8周。相当一部分轰击小抱子需进一…     

黑曲霉糖化酶基因启动子区的克隆及其功能测定

利用PCR技术,以黑曲霉糖化酶高产株T21的基因组DNA为模板合成了糖化酶基因5＇端上游850bp的非编码区,并作了序列测定。将该合成片段与细菌潮霉素磷酸转移酶结构基因融合建成表达质粒,转化黑曲霉,获得了高潮霉素抗性转化子,证实该合成片段具有丝状真菌启动子功能。抗性转化子的Southern分析表明,潮霉素磷酸转移酶基因已整合到受体黑曲霉的基因组DNA中。     

麦角菌

麦角菌（Clavic砂spurpurea（Fr．）Tul．）属于真菌门,子囊菌亚门,核菌纲,球壳目．麦角菌科,麦角菌属。此菌寄生在黑麦、小麦、大麦、燕麦、鹅冠草等禾本科植物的子房内,将于房变为菌核,形状如同麦粒,故称之为麦角。麦角菌生活史1．手囊和子囊抱子2子囊抱子已于囊抱子萌发4受侵害的花5．分生抱子梗及分生池子已分生抱子7分生抱于萌发8．麦穗上生出菌核9．菌核萌发成子座10．雌雄生殖器11．子座纵切示子囊壳排列12．子囊壳纵切示子囊麦角菌的主要寄主是黑麦。当黑麦开花期,麦角菌线状、单细胞的子囊抱子借风力传播到寄生的穗花上…     

黑曲霉糖化酶高产株糖化酶cDNA的合成、克隆和序列分析

从黑曲霉糖化酶高产株T21分离总Poly(A)⁺RNA,经反转录合成cDNA,建立cDNA库。以糖化酶基因片段为探针从cDNA库进行筛选,阳性率达1．6％。由限制酶酶切图谱确定30％的阳性克隆携带全长的糖化酶cDNA。序列分析结果表明,菌株T21虽经多次诱变获得,但糖化酶基因编码区序列与文献报道的黑曲霉糖化酶基因编码区序列一致。从菌株T2l构建的cDNA库中含糖化酶cDNA插入片段的克隆的高比率充分证明,菌株T21中稳态糖化酶mRNA含量很高,显然这是突变株T21糖化酶高产的重要原因之一。     

蓝光诱导促进黑曲霉产糖化酶的研究

考察了蓝光对黑曲霉产糖化酶的影响并采用扫描电镜观察蓝光下黑曲霉形态发育过程,结果表明,与黑暗对照组相比,蓝光处理使菌丝粗壮,孢囊增大,分生孢子发育提前,黑曲霉糖化酶活力增加,孢子发育和产糖化酶的进程有一定的对应性。黑曲霉在黑暗下生长至36h时,经蓝光诱导糖化酶产量提高更为明显,提示了黑曲霉存在一个对蓝光反应产生最适光感应的发育阶段,对于光调节黑曲霉产糖化酶来说,蓝光诱导的光强由弱到强,比持续蓝光培养或采用较高光强诱导效果更好,表明黑曲霉产糖化酶存在一种光适应机制,能够感应和适应光强度变化,调节其自身代谢。从抑制性扣除杂交实验和蓝光光强变化对差异基因表达的分析来看,糖化酶基因以及呼吸链中部分氧化还原酶基因在蓝光诱导下表达皆有增强,蓝光信号转导影响了核基因编码的线粒体呼吸链相关酶基因表达水平,交替氧化酶可能参与了蓝光信号途径,影响了黑曲霉产糖化酶和孢子发育。研究结果可为在现有水平上应用蓝光调节提高糖化酶产量找到新的技术突破口和提供新思路。     

纤维素酶产生菌和糖化酶产生菌液体混合发酵的研究

应用正交试验设计研究了糖化酶高产菌株黑曲霉UV-11(Aspergillus niger UV-11)和纤维素酶高产菌株黑曲霉F_(27)(A.niger F_27)液体混合发酵条件。结果表明,发酵液糖化酶活力为6500U/ml,CMC酶活力为99mg葡萄糖/ml·h。与UV-11单菌发酵相比,糖化酶活力提高16％,CMC酶活力提高266％。     

黑曲霉糖化酶热稳定性的研究

本文报导了黑曲霉糖化酶三种同工酶的相似的热稳定性。活力测定表明,糖化酶在60℃时易失活,三个同工酶的半衰期分别是GⅠ30’,GⅡ48.,GⅢ80’;而对40℃和50℃则有较强的抗性,但其活力曲线呈现复杂的变化,显示出在一定时间内,温热可以诱导酶活提高。紫外吸收及紫外差示光谱表明,在热处理过程中引起了酶分子的构象变化。本文还对酶分子的构象及活力变化的关系进行了探讨。 糖化酶(glucoamylase EC.3.2.1.3)水解淀粉为葡萄糖,是食品酿造工业的重要用酶之一。我们已经从黑曲霉AS.3.4.309变异株B-11发酵液中分离提纯了三种糖化酶的同工酶(1),并对其基本性质进行了研究。本文主要对黑曲霉糖化酶的热稳定性作了进一步的探讨。     

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因和糖化酶基因对工业酒精酵母的整合及其共表达

用PCR合成的黑曲霉 (Aspergillusniger)酸性α 淀粉酶 (Acidα amylase)的cDNA ,构建了由酵母醇脱氢酶(ADH1 )启动子和终止子引导表达 ,酸性α 淀粉酶自身信号肽序列引导分泌的表达元件 ,与黑曲霉糖化酶cDNA的表达元件同时插入由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIp型表达载体pWHY中 ,构成双基因表达分泌质粒pWAG。采用pWAG与酵母YEp型G4 1 8抗性表达质粒的共转化 ,将两个基因表达元件整合到酒精生产酵母菌株AS2 346的染色体rDNA序列中 ,获得同时表达胞外酸性α 淀粉酶和糖化酶的双功能酒精酵母工程菌     

生物防治因子

880305在西非致乏库蚊滋生地区球形芽抱杆菌2362的抱子耐久性和再循环〔英〕/Ni。-olas,L.…了Appl.Mierobiol .Bioteeh-nol一1957,25(4)一341一345〔译自CBA,1987,(4),1768〕 在污水池中,针对致乏库蚊(Cule二qui-啊uefasciatus)幼虫,施用了球形芽抱杆菌(Bacillos sphaerieus)菌株艺362的药液,浓度为109/m“。由于球形芽抱杆菌的抱子沉降速度十分慢,所以彻底防治幼虫可维持5~6周,这与每毫升上表层水中至少有100一500个抱子有关。死亡幼虫体中的球形芽抱杆菌可重复利用,而泥浆中的则不能。预计球形芽抱杆菌配方的成本即使用高剂量也会较…     

黑曲霉3.795glaA基因及其5'调控区的克隆和序列分析

黑曲霉Ｔ２１是由黑曲霉３．７９５经诱变育种获得的糖化酶高产菌株,为阐明其高产的分子机制,由黑曲霉３．７９５克隆了糖化酶结构基因及其５′旁侧序列,并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较．由黑曲霉３．７９５菌丝体分离染色体ＤＮＡ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,糖化酶结构基因位于～２．５ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＥｃｏＲⅤ染色体ＤＮＡ片段上,在此ＥｃｏＲⅠ位点上游约１．０ｋｂ处有一ＳａｌⅠ位点．为构建糖化酶结构基因及其５′旁侧序列的基因组文库,该染色体ＤＮＡ分别用ＥｃｏＲⅠ＋ＥｃｏＲⅤ和ＥｃｏＲ＋ＳａｌⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分离并回收长度在１．０ｋｂ左右和２．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段,分别与ｐＵＣ１９载体连接后转化入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５．用原位杂交方法筛选到了携带糖化酶基因编码区及其１５０５ｂｐ５′旁侧序列的阳性克隆．对克隆片段的ＤＮＡ序列进行了测定并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较,结果表明,在糖化酶基因编码区及其１５０ｂｐ３′非编码区内,未发现碱基差异,但在－３４０～－１５０５的５′上游区内发生了９个位置的碱基变化,包括缺失、插入和替换．这些结果表明,黑曲霉Ｔ２１与３．７９５的糖化酶产量的差异与其结构基因无关,但可能与其     

酶制剂在大曲丢糟再发酵中的应用

目的:在添加糖化酶和纤维素酶的条件下,采用黑曲霉与假丝酵母发酵丢糟生产单细胞蛋白饲料.方法:采用L(34)水平正交试验对糖化酶与纤维素酶的添加量、黑曲霉与假丝酵母的比例、发酵时间进行了探讨.结果:单细胞蛋白饲料生产的最佳生产工艺条件为:糖化酶的添加量为0.03%、纤维素酶的添加量为1.5%、黑曲霉:假丝酵母=1:3、培养时间为8d,产品粗蛋白含量可达38.72%.结论:酶制剂的添加对丢糟转化为单细胞蛋白饲料具有明显的促进作用.     

中国曲霉属的几个新记录和罕见分类群

菌落在查氏琼脂上25℃培养12天直径达4一5.5厘米,质地丝绒状,有较多的分生抱子结构,表面呈不同程度的灰绿色,近于Greenish Glaucous-Blue (R.LⅡ),老后呈灰褐色,近于Light Cinnamon-Drab (R.XLVI),无或具少量渗出液。