利用大肠杆菌细胞工厂生产吲哚-3-乙酸的研究

目的:利用重组大肠杆菌全细胞转化色氨酸生产IAA.方法:在大肠杆菌胞内构建两条全新的IAA合成途径,即吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径和色胺(tryptamine,TRP)途径.结果:IAM途径涉及两个酶,分别是色氨酸-2-单加氧酶(IAAM)和酰胺酶(AMI1),构建好的重组大肠杆...     

解淀粉芽胞杆菌HZ-12中ysnE参与吲哚-3-乙酸合成的代谢途径研究

【目的】吲哚-3-乙酸是调控植物生长发育和生理活动的重要激素,吲哚-3-乙酸N-乙酰转移酶YsnE在吲哚-3-乙酸合成中发挥重要作用,本研究拟解析解淀粉芽胞杆菌中YsnE参与吲哚-3-乙酸合成的代谢途径。【方法】通过基因ysnE缺失和强化表达,分析ysnE对吲哚-3-乙酸合成影响,结合吲哚-3-乙酸合成中间物(吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺、色胺和吲哚乙腈)添加和体外酶转化实验,解析ysnE参与吲哚-3-乙酸合成的代谢途径。【结果】明确了YsnE在解淀粉芽胞杆菌HZ-12吲哚-3-乙酸合成中发挥重要作用。发现ysnE缺失菌株中的吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺和吲哚乙腈利用显著降低,揭示了YsnE主要发挥吲哚丙酮酸脱羧酶YclB和吲哚乙酰胺水解酶/腈水解酶/腈水合酶YhcX的功能,并通过参与吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺和吲哚乙腈途径来影响吲哚-3-乙酸合成。【结论】初步揭示了YsnE通过影响吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺和吲哚乙腈途径参与吲哚-3-乙酸合成的代谢机理,为吲哚-3-乙酸合成途径解析和代谢工程育种构建吲哚-3-乙酸高产菌株奠定了基础。     

吲哚乙酸在植物细胞中的代谢及其作用

IAA在植物体内参加了细胞伸长生长、形成层细胞分裂、维管组织分化、叶片和花的脱落等许多生理生化过程的调节与控制,对植物的顶端优势、向性、同化物的运输等也有调节作用。植物体通过IAA的生理作用依赖于IAA在细胞内的合成、代谢并通过不同的信号传导途径引起不同效应。     

吲哚-3-甲醛对志贺菌感染的保护作用及其机制研究

【目的】探究吲哚-3-甲醛(indole-3-carboxaldehyde,I3A)对志贺菌感染性结肠炎的缓解作用及其机制研究。【方法】体外实验,通过微量肉汤稀释法测定I3A对志贺菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和I3A的抗菌活性,运用酶标仪测定600 nm处不同浓度I3A作用的菌液吸光度(A₆₀₀),并通过平板菌落计数检测志贺菌量。体内实验,将18只小鼠随机分为对照(NC)组、SF301组和SF301+I3A组。然后SF301+I3A组进行连续8 d的200 µL I3A灌胃处理,同时NC组和SF301组用200 µL无菌水灌胃处理,SF301组和SF301+I3A组于灌药第4天制备志贺菌感染性结肠炎小鼠模型,体重和疾病活动指数(disease activity index,DAI)用于评价小鼠状况。上述实验结束后将所有小鼠处死,取中段结肠进行组织病理学检测观察炎症情况,下段结肠检测白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平,粪便、盲肠内容物检测载菌量。同时进行14 d的I3A处理小鼠监测I3A的体内应用安全性。【结果】体外实验：I3A的MIC为128 µg/mL,不同浓度的I3A涂板计数和A₆₀₀结果与对照组比较,均有统计学差异(均P<0.05)。体内实验：与SF301组相比,SF301+I3A组小鼠体重和DAI更接近NC组,肉眼观结肠组织无明显损伤,组织病理学检查未见明显炎症,载菌量和炎性因子均有统计学差异(均P<0.05);I3A对小鼠体重变化无显著影响(P>0.05)。【结论】本研究证明I3A在志贺菌感染性结肠炎中对肠道具有保护作用,I3A可通过抑制志贺菌载菌量、降低结肠损伤和炎症水平来缓解志贺菌感染性结肠炎,并且I3A在体内没有显示毒性。     

喷施吲哚-3-乙酸 (IAA) 对番茄及其上B型烟粉虱的影响

【目的】不同植物生长调节物质对植食性昆虫产卵、发育、取食等常有促进或抑制作用,进而影响植物与昆虫的互作关系。本研究旨在阐明常用的植物生长调节剂吲哚-3-乙酸对B型烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)的影响,进而探索防治烟粉虱环境友好的方法,同时期望获得更加优质的烟粉虱用作替代寄主饲养寄生蜂。【方法】对番茄 Solanum lycopersicum L.植株外源喷施吲哚-3-乙酸(IAA),检测其生理生化的响应;记录B型烟粉虱存活率、产卵量并测量解毒酶等指标。【结果】喷施IAA后番茄叶片含水量略有上升,叶面积增大,叶绿素含量增加,过氧化物酶(POD)活性降低,多酚氧化酶(PPO)活性升高,超氧化物歧化酶(SOD)活性变化不显著(P＞0.05)。喷施IAA后番茄上B型烟粉虱成虫存活率高于对照组,其中50 mg/L IAA番茄上B型烟粉虱成虫存活率和总产卵量最高,250 mg/L IAA存活率最低;喷施IAA 120 h后烟粉虱总产卵量升高;碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性较对照升高。【结论】喷施不同浓度的IAA溶液后,番茄植株的生理生化水平发生不同程度的改变,烟粉虱成虫的存活状况、产卵量以及体内解毒活性也会产生不同程度的改变。适宜剂量的IAA处理能够使烟粉虱的生存表现更加优异,从而为饲养寄生蜂提供优质的替代寄主。     

用溴甲基五氟苯衍生气相色谱法测定葡萄浆果中的脱落酸和吲哚-3-乙酸

ＡＢＡ和ＩＡＡ是葡萄浆果中的两个重要激素,用溴甲基五氟苯对其衍生、酯化成各具有５个氟的两种衍生物,这两种酯在气相色谱柱上分离效果良好,对电子检测器反应敏感。该方法操作简单,精确度高     

拟南芥吲哚—3—甘油磷酸合酶免疫分析

吲哚３甘油磷酸合酶（ＩＧＳ,ｉｎｄｏｌｅ３ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ,ＥＣ４．１．１．４８）在色氨酸与吲哚乙酸的生物合成途径中,催化生成吲哚３甘油磷酸。研究该基因的表达调控,对于阐明高等植物是如何调控色氨酸及生长素合成是十分重要的。利用已克隆的ＩＧＳｃＤＮＡ,构建了谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ,ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＥＣ２．５．１．１８）与吲哚３甘油磷酸合酶融合蛋白的表达质粒,并将其导入到在异丙基βＤ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导下能高效表达的ＩＧＳ基因缺陷菌株ｔｒｐＣ９８００λＫＣ大肠杆菌中。高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽琼脂糖（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅａｇａｒｏｓｅ）亲和层析和ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,用以免疫兔子制备抗血清。免疫印迹法分析表明拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）四种常用生态型只合成一种分子量约为４０ｋＤ的吲哚３甘油磷酸合酶蛋白。在Ａｇ＋、紫外线等逆境条件下,ＩＧＳ含量都有较大幅度的增加,这说明ＩＧＳ可能与植物的防御反应紧密相关。     

棉纤维初始发育过程中过氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶的活性

选用互为近等基因系的陆地棉品种徐州１４２和无絮棉突变体,比较研究开花前５ｄ至开花后６ｄ胚珠内可溶性蛋白质含量,ＰＯＤ和ＩＡＡ氧化酶活性的变化,结果表明,开花前３ｄ至１ｄ蛋白质大量合成可能与纤维发育相关基因的表达有联系,而ＰＯＤ和ＩＡＡ氧化酶阻碍纤维的初始发育。     

在吲哚乙酸不同位点偶联载体蛋白对其抗体特异性的影响

分别选择吲哚乙醇分子上的Ｃ１位羧基和吲哚环上的Ｎ位作为偶联载体蛋白的位点,用混合酸酐法和甲醛搭桥法分别合成了两种免疫原ＩＡＡ—ＣＯ—ＮＨ一ＨＳＡ和ＩＡＡ－Ｎ－ＢＳＡ,并进而制得了对吲哚乙酸侧链识别能力不同的两种多克隆抗体,分别可特异识别甲酯化ＩＡＡ和游离态ＩＡＡ;用碳化二亚胺法和甲醛搭桥法分别合成ＩＡＡ—ＣＯ—ＮＨ－ＢＳＡｂＩＡＡ—Ｎ—ＯＶＡ两种复合物,以之为包被物,建立了两种ＩＡＡＥＬＩＳＡ。其灵敏度分别为０．３５ｐｍｏｌ和１．８０ｐｐｍｏｌ;检测范围分别为０．７８～８００ｐｍｏｌ和１．９５～２０００ｐｍｏｌ;批内变异系数分别为４．４５％和４．７９％;批间变异系数分别为１．１５％和１．５０％。笔者用这两种ＥＬＩＳＡ检测了兰花气生根和桑树苗样品中ＩＡＡ的含量,发现两种检测结果相当一致。     

α-溴-2、3、4、5、6五氟甲苯衍生气相色谱同时测定吲-3-乙酸和脱落酸

用α-溴-2、3、4、5、6五氟甲苯作衍生剂,在55℃反应90分钟可与吲哚-3-乙酸和脱落酸生成酯。这两种酯可用气相色谱分离,电子捕获检测器测定。本方法操作简单、灵敏度高。最小检测量:吲哚-3-乙酸和脱落酸分别为10~(-14)g 和10~(-13)g。     

吲哚胺2,3-二加氧酶与肿瘤的免疫耐受

肿瘤能引起针对肿瘤相关抗原的免疫耐受,但是其机制不清楚。最新研究表明,吲哚胺2,3-二加氧酶（idoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）催化的色氨酸降解代谢与这种免疫耐受有关。肿瘤细胞不仅自身能表达IDO,而且还吸引表达IDO的宿主抗原提呈细胞聚集在肿瘤组织附近。这些特征可能是肿瘤抗原免疫耐受的一个有效机制,而抑制IDO可能成为肿瘤免疫治疗的新策略。     

稀土-落叶松单宁配合物的合成及抗真菌活性研究

以稀土(Re~(3+))和落叶松单宁(LT)为原料,采用液相合成法合成了5种廉价的稀土-落叶松单宁(Re~(3+)-LT)配合物,并通过红外光谱、X射线光电子能谱、紫外光谱以及配位数测定确定了配合物的结构.采用牛津杯法、琼脂稀释法测定配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉4种真菌的抑制作用.在抑菌方面,5种配合物对上述4种真菌均具有较强的抑制作用,其抑菌活性大小顺序为Ce~(3+)-LTGd~(3+)-LTLa~(3+)-LTNd~(3+)-LTYb~(3+)-LT,其中Ce~(3+)-LT对4种真菌的最小抑菌浓度分别为:1.6、1.6、0.8和1.6 g·L~(-1);Yb~(3+)-LT对4种真菌的最小抑菌浓度分别为:3.2、1.6、3.2和3.2 g·L~(-1).在杀菌方面,Yb~(3+)-LT的杀菌活性最强,其对4种真菌的最小杀菌浓度分别为:6.4、3.2、3.2和6.4 g·L~(-1).此外,尽管Nd~(3+)-LT和Gd~(3+)-LT具有较强的抑菌活性,但对黑曲霉和毛霉的杀菌作用较弱.     

高产吲哚乙酸及高泌氨巴西固氨螺菌的筛选与鉴定

目的：从玉米根际和土壤中分离具有高产吲哚乙酸较强的泌氨能力的巴西固氮螺菌。方法：分别通过半固体NFb培养基、CR培养基、LB培养基分离培养固氮菌株,并经过一系列菌落菌体形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列测定等试验对其进行鉴定。结果：经分离纯化获得10株固氮菌,并鉴定均为巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）,其中菌株R7在甘油半固体培养基上能分泌约14mmol/L的氨,在添加了色氨酸的培养基中能够合成58.8μg/ml的吲哚-3-乙酸（IAA）。结论：成功筛选得到一株既高产吲哚乙酸又有较强的泌氨能力的巴西固氮螺菌。     

DL-α-白氨酸与稀土硝酸盐固体配合物的合成及性质

用白氨酸分别和三种稀土硝酸盐在有机溶剂中首次合成了三种相应的1:2型固体配合物,经化学分析和元素分析确定了其组成为RE(Leu)_2(NO_3)_3·2H_2O(RE=Ce,Nd,Sm;Leu=DL-α-Leucine)。并通过X—粉晶衍射、红外光谱、TG—DTG和电导等对其性质进行了讨论。     

异戊烯基化吲哚类生物碱的化学酶合成

异戊烯基化吲哚类生物碱广泛存在于麦角菌、青霉菌和曲霉菌中,具有一定的药理学活性,与未异戊烯基化的前体在生物活性方面具有明显的差异.曲霉菌中的某些异戊烯基化吲哚类生物碱具有抗癌活性,如烟曲霉毒素C（fumitremorgin C）、tryprostatin B,但其天然产量低且不易分离,利用化学酶合成法可很容易地将前体转化为异戊烯基化吲哚类生物碱.异戊烯基转移酶FtmPT1对二甲丙烯基二磷酸（dimethylallyl diphosphate,DMAPP）具有专一性,但可以接受不同的芳香族底物.早期研究发现,FtmPT1能接受含色氨酸的不同环二肽为底物,但以cyclo-L-Trp-L-Tyr和cyclo-L-Trp-L-Phe为底物时,酶的相对活性很低,其产物量少,无法用于合成产物.本实验通过优化酶反应条件来提高其产量.将已构建的含ftmPT1的质粒在大肠杆菌中诱导表达,经Ni-NTA亲和柱纯化后用于酶反应.实验结果表明,通过增加酶量（终浓度2.8 μmol/L）、延长培养时间（37 ℃,24 h）,以cyclo-L-Trp-L-Tyr和cyclo-L-Trp-L-Phe为底物的酶反应产率分别达到49.3%和21.3%,产物经¹H^-NMR、¹H-¹H-COSY和ESI-MS鉴定,其结果与预期吻合.据检索,这2个化合物均为新化合物,分别命名为cyclo-C2-1′-DMA-L-Trp-L-Tyr和cyclo-C2-1′-DMA-L-Trp-L-Phe.     

海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173合成的2-吲哚酮生物碱

【背景】海洋来源的天然产物近年来已成为小分子药物的重要来源。对海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173的基因组分析显示,该菌包含多种天然产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】挖掘B9173菌株中未知的次级代谢产物,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物。【方法】利用HPLC/LC-MS结合的方法,排除了该菌株产生的已知化合物,确定3个未知化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,最后得到化合物单体。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定。【结果】确定3个化合物分别是色胺酮、甲基异靛蓝和N,N-二甲基异靛蓝,三者都属于2-吲哚酮生物碱。其中色胺酮具有非常广的生物活性,包括抗菌、抗肿瘤、抗炎症等,是药物开发的良好前体,这是首次在细菌中被分离得到。甲基异靛蓝是我国临床治疗慢性粒细胞白血病的药物,这是首次在微生物发酵液中被分离得到。目前这3个化合物均主要依赖化学合成。本研究结合B9173菌株的代谢背景,推测了3个化合物的生物合成途径。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从B9173菌株的发酵液中分离鉴定了3个2-吲哚酮生物碱,丰富了微生物活性天然产物的种类,对3个化合物生物合成途径的推测也为进一步研究色胺酮和甲基异靛蓝的生物合成机制奠定基础,后续可利用合成生物学技术重构这类化合物的生物合成途径,提供更便捷、低成本的生物合成方法。     

镍离子──氨基酸配合物的合成及其分析

本文着重研究了镍离子与两种氨基酸配合物的合成,并对配合物的结构进行了分析。     

吲哚丁酸对桉树插条多酚氧化酶的影响及其与生根的关系

尾叶桉MLA无性系(简称MLA)为难生根植物,尾叶桉U6无性系(简称U6)和刚果12号桉W5无性系(简称W5)为易生根植物。MLA插条内的PPO活性比U6、W5的低。用吲哚丁酸(IBA)处理桉树的插条后,在扦插生根的不同阶段,插条内的PPO活性呈现规律性的变化。蛋白质含量呈上升趋势。PPO同工酶谱带也随生根的进程出现增多现象。讨论了多酚氧化酶与桉树插条生根的关系。     

2,3-吲哚醌对MCF-7和HT-29细胞株的增殖抑制和凋亡诱导

目的:研究2,3-吲哚醌(2,3-dioxoindoline,ISA)对人乳腺癌细胞株MCF-7和人大肠癌细胞株HT-29的增殖与凋亡影响.方法:应用MTT比色法检测ISA对MCF-7和HT-29的生长抑制情况;Hochest33258荧光染色法检测细胞凋亡情况,Westem Blotting 法检测凋亡相关基因bcl-2和bax在蛋白水平上的表达;RT-PCR两步法检测bcl-2和bax在mRNA水平上的变化.结果:①ISA在一定浓度范围内能明显抑制细胞生长;②荧光染色可观察到细胞核染色质浓集,核浓缩核碎裂,并出现典型的凋亡小体;③bcl-2 mRNA及蛋白的表达随药物浓度增大而逐渐减少,各实验处理组与阴性对照组比较存在统计学差异(P＜0.05或P＜0.01).bax mRNA及蛋白的表达随药物浓度增大而无明显变化,各组间比较不存在统计学差异(P＞0.05).结论:ISA能够抑制MCF-7和HT-29细胞增殖,并能进一步诱导其凋亡,其作用机制可能是与下调bcl-2表达有关.     

瑞香素及噁唑类小分子抑制吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)的研究北大核心CSCD

吲哚胺-2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)在肿瘤免疫中发挥了重要作用,为了获得新型的IDO1小分子抑制剂,本研究利用He La细胞系建立了IDO1抑制剂筛选模型,筛选抑制IDO1活性的天然小分子化合物。将He La细胞接种于48孔板中,加入干扰素-γ(IFN-γ)诱导He La细胞中IDO1的表达,检测HeLa细胞分泌IDO1的酶代谢活性。对化合物库筛选后发现瑞香素(Daphnetin)和一个噁唑类小分子ZH-26能够抑制IDO1酶活性,采用Graph Pad Prism计算瑞香素和ZH-26的IC50值,结果显示瑞香素的IC50为16. 50±0. 33μM,ZH-26的IC50为4. 68±0. 21μM。进一步在HEK-293A细胞中过表达IDO1,不同浓度瑞香素和ZH-26处理细胞后也表现出对IDO1活性的抑制作用。采用Western blot方法发现瑞香素显著下调IFN-γ诱导的IDO1蛋白表达,而ZH-26则对IFN-γ诱导的IDO1的表达没有影响。综上,瑞香素和ZH-26在He La细胞内没有发现明显的细胞毒作用。本实验首次发现了瑞香素和ZH-26具有抑制IDO1的活性,不但为了解瑞香素这一天然来源临床药物的抗肿瘤机制提供新的视角,也为开发新的靶向IDO1的肿瘤免疫治疗候选药物奠定了基础。