甲基对硫磷水解酶基因的克隆与融合表达

利用鸟枪法从甲基对硫磷降解菌DLL-1 Peudomonas putida）中克隆了甲基对硫磷水解酶基因(mpd)片段2．5kb,并进行了测序。通过软件分析开放阅读框和启动子序列,表明该序列中最可能为甲基对硫磷水解酶结构基因的阅读框为769—1794区域。软件分析还表明该水解酶前端45个氨基酸为典型的信号肽结构。通过PCR扩增了mpd结构基因,亚克隆到表达载体pET—32a中,构建了完整的融合表达载体pET—MP。转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下2～4h甲基对硫磷水解酶表达可以达到最高水平;同时还研究了乳糖的诱导效果,2％乳糖诱导2h就可以起到很好的效果。通过PCR反应验证了mpd基因定位于DLL-E4的染色体而不是质粒上。     

假单胞菌WBC—3甲基对硫磷水解酶性质的初步研究

从最近分离到的有机磷农药降解菌Pseudomonas sp．WBC—3中获得了甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase,MPH,EC3．1．8．3)。该酶在48h的培养物中分布比例分别为：上清液2．1％,胞内86．2％和胞间质11．7％,说明MPH为胞内酶。经过CM—sepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得电泳纯的酶。SDS—PAGE和凝胶过滤层析表明,该酶为单体蛋白,分子量约为34kD。动力学分析显示该酶为非特异性有机磷降解酶,但最适底物为甲基对硫磷。在pH9～12范围,酶表现较高活力水平,最高活力的反应温度为40℃。根据各类金属离子和鳌合剂对酶活的影响,推测MPH为金属酶。     

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。     

陆地棉干旱胁迫相关基因GhTrx的克隆及表达

采用RACE和RT-PCR技术,克隆了陆地棉干旱胁迫硫氧还蛋白基因,利用荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织和不同时期的表达情况.结果表明,陆地棉硫氧还蛋白基因(GhTrx)的cDNA全长1 340 bp,其中ORF 864 bp,推测编码288个氨基酸.该基因编码蛋白与杨树、蓖麻、拟南芥的相似性分别为70%、72%和76%,系统发育树分析显示,GhTrx与蓖麻中该蛋白的亲缘关系最近.RT-PCR分析显示,GhTrx基因表达受干旱胁迫诱导,在干旱诱导下,该基因在抗旱材料中H177中上调表达,在根中的表达量明显高于叶.研究表明,GhTrx基因在干旱胁迫时根部进行大量表达,对抵御外界的干旱威胁起到关键作用,可能对提高陆地棉抗旱性方面具有一定的作用.     

一种新型改良硫氧还蛋白融合表达体系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表达

通过改良硫氧还蛋白融合表达体系,原核表达cathelicidin家族抗菌肽Lf-CATH2。首先在Lf-CATH2基因上游加入凝血酶位点,并去除p ET32α载体的凝血酶序列和S标签序列,构建优化的Lf-CATH2-p ET32α-TS载体,于大肠杆菌中表达。产物融合蛋白经凝血酶切割释放Lf-CATH2,纯化后进行抗菌活性检测。结果表明改良的硫氧还蛋白融合表达体系显著提高酶切效率达37%,Lf-CATH2在新体系中获得了可溶性高表达,且保留了抗菌活性。因此该新型硫氧还蛋白融合表达体系,有望为cathelicidin家族及其他阳离子活性肽提供更好的原核表达载体工具。     

节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化

目的：构建节杆菌BT801乙内酰脲水解酶（HyuH）与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化。方法：将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的HyuH活性;最后利用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂纯化融合蛋白GST-HyuH。结果：SDS-PAGE表明重组菌在相对分子质量77×103处有特异的蛋白表达条带,且重组菌可以水解5-苯基乙内酰脲,纯化得到了有HyuH活性的纯度较高的GST-HyuH融合蛋白。结论：得到了有HyuH活性的GST-HyuH,为进一步研究HyuH的修饰奠定了基础。     

人硫氧还蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对内毒素血症小鼠的保护作用

为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现 ,TRX蛋白可明显促进去细胞因子诱导的NFS 6 0细胞增殖和撤血清后MCF 7细胞的增殖 ,并发现外源性TRX可明显对小鼠内毒素血症起保护作用 .     

非特异性脂质转移蛋白突变体的构建及在两种硫氧还蛋白表达载体中的表达比较

对水稻非特异性脂质转移蛋白(Nospecific lipid transfer protein,nsLTP) LTP110中结构重要的5个氨基酸位点进行了定点突变,测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达。将编码野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A,D45A,C50A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较：pTrxFus载体可以在宿主菌GI724中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A融合蛋白,但不能表达D45A和C50A融合蛋白;pET32a(+)载体可以在宿主菌BL21 (DE3) trxB-中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白,且表达量比在pTrxFus载体/GI724突主菌中表达量高。对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化,并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活,结果表明表达的野生型LTP110分子具有结合脂质的活性。     

TXNIP基因与肿瘤发生及转移

硫氧还蛋白结合蛋白（thioredoxin interacting protein, TXNIP）在细胞增殖、凋亡、分化的过程以及肿瘤、应激性疾病的发生中具有重要功能. 作为一个氧还反应的调节子,TXNIP能与硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)相结合,下调Trx的表达,而Trx则在DNA的损伤及细胞凋亡机制中有着关键的作用. 本文阐述了TXNIP基因的特征及其蛋白的生物学功能, 并简要总结TXNIP在人类肿瘤中低表达的研究成果. TXNIP基因是一个新的抑癌基因,它在人类乳腺癌、肝癌、肺癌等癌组织细胞中均表达下降, 并且与肿瘤的转移相关. TXNIP的缺失可以促使肿瘤细胞的增殖和抑制细胞凋亡的进程. 而在抗肿瘤机制中, TXNIP可通过参与细胞周期阻滞、低氧调节、影响NK细胞(natural killer cell, NK cell)发育等过程介导肿瘤的发生发展.     

假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶性质的初步研究

从最近分离到的有机磷农药降解菌Pseudomonassp. WBC3中获得了甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH,EC 3183）。该酶在48h的培养物中分布比例分别为：上清液2.1%, 胞内862%和胞间质11.7%,说明MPH为胞内酶。经过Cmsepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得电泳纯的酶。SDSPAGE和凝胶过滤层析表明,该酶为单体蛋白,分子量约为34kD。动力学分析显示该酶为非特异性有机磷降解酶,但最适底物为甲基对硫磷。在pH9～12范围,酶表现较高活力水平,最高活力的反应温度为40℃。根据各类金属离子和鳌合剂对酶活的影响,推测MPH为金属酶。     

甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因,构建了重组表达质粒pET29a_mpd,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,得到C末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶,用NiNTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时,最适pH86～8.8,最佳反应温度15℃;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加15%～20%,Ca2+、Mg2+微弱地促进酶的作用,Ni2+对酶活性几乎无影响;1mmol/L EDTA·Na2+几乎不影响酶的活性,而10mmol/L EDTA·Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时,最适pH86。25℃时,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为（68.6 ± 5.1）μmol/L,kcat为（45 ± 6 ）S-1;对乙基对硫磷的米氏常数Km为（59.5 ± 6.0）μmol/L,kcat为（8 ± 1） S-1。Kcat/Km表明甲基对硫磷水解酶对甲基对硫磷的催化效率更高。     

Isolation of Methyl Parathion-Degrading Strain M6 and Cloning of the Methyl Parathion Hydrolase Gene

A degradative bacterium, M6, was isolated and presumptively identified as Plesiomonas sp. strain M6 was able to hydrolyze methyl parathion to p-nitrophenol. A novel organophosphate hydrolase gene designated mpd was selected from its genomic library prepared by shotgun cloning. The nucleotide sequence of the mpd gene was determined. The gene could be effectively expressed in Esherichia coli.     

转解毒酶基因工程菌的构建及酶活性分析

实验构建了能高效降解有机磷、有机氯等四大类农药的转解毒酶基因工程菌。将抗性库蚊解毒酶酯酶B1基因片段引入融合表达载体pThioHisA中,转化入大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下,经过8 h,酯酶B1在大肠杆菌中的获得融合高效表达。研究了工程菌的酶酯活性,重组质粒pThioHisA-B1表达的酯酶融合蛋白具有较高的酯酶B1活性,能高效降解酯酶的特异性底物α-乙酸萘酯(-αNA)和β-乙酸萘酯(-βNA),该工程菌将为农药污染的生物治理提供新手段。     

甲基对硫磷水解酶参与催化相关结构的研究

甲基对硫磷水解酶（MPH）是一种新的有机磷水解酶。将完整的甲基对硫磷水解酶基因（mpd）构建入pUC19载体,使得mpd基因以自身的启动子在Escherichia coli DH5α中表达并得到了纯化。金属螯合实验发现MPH的活性不受金属螯合剂1, 10菲NFDA1啉的影响;但用电感耦合等离子发射光谱测定其金属含量显示MPH是金属酶,1mol酶中结合了2mol的Zn²⁺。为确定参与MPH催化活性的必需氨基酸,用化学修饰剂碳化二亚胺、二乙基焦磷酸酯、磷酸吡哆醛和丁二酮处理MPH,然后检测其残余酶活力,结果表明天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸残基与酶的催化活性无关;而二乙基焦磷酸酯对组氨酸侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度的下降,其对酶活性的抑制率达到9.6h^-1,说明组氨酸是酶活力所必需的基团。这些结果为进一步研究酶的结构及对酶进行分子改造提供了必要的基础数据。     

High-Level Expression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis WB800

The methyl parathion hydrolase (MPH)-encoding gene mpd was placed under the control of the P43 promoter and Bacillus subtilis nprB signal peptide-encoding sequence. High-level expression and secretion of mature, authentic, and stable MPH were achieved using the protease-deficient strain B. subtilis WB800 as the host.     

Expression, purification and characterization of human urodilatin in E. coli

Urodilatin is a 32-amino acid peptide hormone synthesized in kidney to regulate natriuresis and diuresis. It has been shown clinically useful for the treatment of acute decompensated heart failure. A synthetic deoxyoligonucleotide encoding urodilatin was cloned into a pET32a vector immediately after the thioredoxin encoding sequence with a hexa-hisditine tag and an enterokinase recognition site incorporated in between. The fusion protein was overexpressed in Escherichia coli, which constituted 28% of the total cell proteins. More than 85% of Trx-urodilatin was soluble and purified nearly homogenous by Ni-Sepharose affinity chromatography. Urodilatin was then released from the fusion protein by the enterokinase treatment and separated from the fusion partner by the subtractive chromatography using Ni-Sepharose once again. The urodilatin sample was further purified with reverse phase HPLC. Via a biological activity assayed in vitro, it was found that urodilatin had a potent vasodilatory effect on rabbit aortic strips with an EC50 of (2.02+/-0.36)x10(-6)mg/ml, which was similar to that of the synthetic urodilatin standard. The method described here promises to produce about 4.5mg fully active recombinant urodilatin with homogeneity over 97% from one liter shaking flask culture of E. coli.     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因真核表达载体的构建及其功能的研究

目的:蛇毒纤维蛋白溶解酶能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原,在心脑血管疾病的治疗方面具有潜在的应用价值。方法:采用双酶切技术从pMD18T-FLE I克隆载体上获得中介蝮蛇毒纤溶酶基因编码区,再将其亚克隆到真核表达载体pFASTBACHTa上,经转化、筛选和鉴定,获得重组真核表达质粒pFASTBACHTa-FLE。重组质粒经小鼠尾静脉快速注入小鼠体内,进行瞬时表达。结果:经SDS-PAGE和Western blot检测,表明在小鼠肝脏组织中有重组FLE蛋白表达。免疫组织化学检测证明该蛋白在小鼠肝脏组织中大量表达。纤维蛋白平板法鉴定该重组蛋白具有较高的纤溶活性,其活性呈现出剂量相关性和时间依赖性。因此为进一步对中介蝮蛇毒纤溶酶的应用奠定了坚实的基础。     

降低PARP酶活性对外源基因稳定整合的影响

通过使用 PARP酶的抑制剂研究了降低PARP酶的活性对外源基因转染效率及整合作用的影响, 结果表明,转染的外源基因的吸收及瞬时表达不依赖于PARP酶的活性,而外源基因的整合作用与PARP酶的活性有关。 Abstract:In this study,the effect of lowering PARP activity on the transfection of cultured cells with foreigh genes was evaluated.The results indicated that PARP enzyme involved in the stable integration of foreign genes into the host genome.However,inhibition of PARP activity exhibited no effect on both the uptake into the cells and the expression of the forging genes.