Ames试验中菌落呈色计数法的探讨

本实验利用氯化三苯四氮唑(TTC)使革兰氏阴性菌显色的原理,在平板法Ames试验中,添加TTC浓度为lmg/皿时,使测试菌株(鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型株TA97、TA98、TA100、TA102)呈为红色。试验证明TTC本身无诱变性,亦不干扰阳性物(2-AF)的诱变性。菌落呈色后便于菌落计数,并在一定程度上提高试验结果的准确性。     

Ames试验中菌落呈色计数法的探讨

本实验利用氯化三苯四氮唑(TTC)使革兰氏阴性菌显色的原理,在平板法Ames试验中,添加TTc浓度为1mg/皿时,使测试菌株(鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型株TA97、TA98、TA100、TA102)呈为红色。试验证明TTC本身无诱变性,亦不干扰阳性物(2-AF)的诱变性。菌落呈色后便于菌落计数,并在一定程度上提高试验结果的准确性。     

细菌总数测定方法的改进

目前细菌总数测定一般采用常规平皿法,用肉眼观察计数。但深层的小菌落容易遗漏,易造成计数上的误差。由于多数细菌具有脱氢酶,在培养基中能产生脱氢作用,当遇到氯化三苯基四氮唑(TTC)存在时会发生显色反应。但高浓度的TTC对细菌具有抑制作用。因此在     

海产品中副溶血性弧菌的直接定量法-疏水网格滤膜法

本研究建立了一种疏水网格滤膜法,直接定量检测海产品中的副溶血性弧菌。该方法包括4~5 h复苏步骤以使受损细胞得以修复,然后37℃下在副溶血性弧菌显色培养基上培养过夜后计数。从显色培养基上挑取典型菌落进行确证试验,确证率大于98%。与传统MPN法比较,对经过冷藏、冷冻和热处理的样品进行检测时,新方法检出菌量明显高于MPN法(p0.01)。     

从冻煮青柳蛤肉中检出阿贡纳沙门菌及定量分析

为了掌握丹东口岸进出口冷冻水产品中沙门菌的污染情况和污染程度,采用GB/T 4789.4-2003前增菌和mini-VADIS法快速筛选,对阳性的样品用选择性琼脂平板划线分离并挑取可疑菌落,进行BBL.crysta自动细菌分析鉴定.采用此法从一批冻煮青柳蛤肉中检出了阿贡纳沙门菌,经 MPN法计数结果为2.3/g.该血清型是引起畜禽类和人类沙门菌病传染的重要血清型,应加强对进出口冷冻水产品的卫生监测.     

一种通用的氨基酸生产菌筛选法

<正> 在氨基酸育种工作中,高产菌株的筛选是项困难的工作。因为平板上的菌落分泌的氨基酸无法直接显色,所以通常不能在平板上直接筛选产生氨基酸的菌株。氨基酸生产菌的筛选一般是在平板上挑取带有定向育种标记的单菌落,接种到大试管或三角瓶中摇瓶发酵,发酵结束后取各个样品点在滤纸上,然后用相应氨基酸的待殊茚三酮显色反     

基于Photoshop 和计数软件精准计数平板上菌落的新方法

正"菌落总数"是农业、食品、医药卫生等行业进行质量检测的重要指标之一,目前常规的菌落计数方法是肉眼观察平皿逐个计数,需要花费较多的时间和精力[1-2]。本文推荐一种简便的平板菌落计数方法,经过使用和验证,与目测直接计数法相比,其计数结果更加准确,且效果明显优于菌落自动计数仪计数结果。现将方法介绍如下。     

细菌平板菌落计数的改进方法

细菌平板菌落计数是微生物教学、科研及生产实践中最常用的活细菌总数测定方法。由于它是根据固体平板上一个菌落代表一个细菌的原理而设计的,因此深层菌落的存在、菌落的大小及疏密程度等因素均影响观察者观察计数。为便于观察.提高菌落的检出率,对常规平板菌落计数法做如下改进: 在倒平板之前,向装有150ml牛肉膏蛋白胨固体培养基的三角瓶内加入1/1000浓度的氧化还原染料     

建立维生素K_1微生物限度测定方法

目的:根据计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验结果,建立维生素K1微生物限度测定方法。方法:以聚山梨酯80作为乳化剂,使维生素K1在p H 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中充分乳化。取1:20供试液1 m L,按平皿法分别用营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基培养,以计数细菌、霉菌和酵母菌。结果:验证所用培养基的菌落平均数均大于对照培养基上的70%,且菌落形态大小一致。稀释液对照组和试验组培养基上菌落平均数的回收率均大于70%,且菌落形态大小一致。三批维生素K1及其加速和长期稳定性样品中均未见菌落。结论:所选培养基适宜大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌生长。且含聚山梨酯80的p H 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和维生素K1对所含大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌无抑菌性。     

空肠弯曲菌活而不可培养状态的产毒素能力及毒素基因表达的检测

目的 通过诱导空肠弯曲菌进入活的不可培养(VBNC)状态建立细胞学模型,用VeroE6细胞和HeLa细胞检测空肠弯曲菌产细胞膨胀性肠毒素(cytotoxic distendingtoxin,CDT)能力的改变,并在RNA水平上进一步验证毒素的表达。方法 采用4℃冷藏及-70℃冷冻的方法诱导空肠弯曲菌进入VBNC状态,利用细胞总数计算、活细胞染色计数及可培养细胞计数间接确证VBNC状态细菌的存在,细胞对于VBNC状态下的细菌仍然敏感,并用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实空肠弯曲菌毒素基因的表达。结果 3种不同状态的细胞计数结果表明存活细胞进入了VBNC状态,细菌经4℃冷藏及-70℃冷冻后数量减少约1个数量级,在冷冻前,细菌对细胞毒性较强,72h时70%以上细胞凋亡,冷冻后的VBNC状态细菌对VeroE6和HeLa细胞的生长仍有影响,72h时约有40%细胞进入凋亡状态。结论 低温、贫养条件下空肠弯曲菌可进入VBNC状态,用常规传统的羊血平板培养基仅能使不到10%的空肠弯曲菌复苏生长,从而可以检测,在VBNC状态时,空肠弯曲菌产毒素能力改变较大,远远低于正常状态,但仍具备产毒素的能力,也从RNA水平实验得到证实。     

ChromID ESBL选择性显色平板对产ESBLs肠杆菌科细菌筛选效果的评价

目的 评价ChromID ESBL选择性显色平板对产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肠杆菌科细菌的筛选效果。方法 选取临床分离的371株肠杆菌科细菌进行ESBLs的检测,用ChromID ESBL选择性显色平板做筛选试验,同时用纸片确证法做确证试验,采用Kappa检验对两者结果进行一致性分析。结果 两种方法对371株肠杆菌科细菌ESBLs检测的总Kappa值为0.761。ChromID ESBL选择性显色平板法的总灵敏度为95.2%,总特异度为83.5%。对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌分别统计,其Kappa值分别为0.832、0.514、0.778;ChromID ESBL选择性显色平板法对其检测灵敏度分别为95.7%、91.3%、100.0%,特异度分别87.6%、72.9%、90.9%。另外有6株大肠埃希菌在该显色平板上显非特征色。结论 ChromID ESBL选择性显色平板对产ESBLs肠杆菌科细菌的筛选效果与纸片确证法总体一致性较好,其灵敏度和特异度较高,可应用于临床。但该显色平板对产ESBLs肺炎克雷伯菌的筛选效果与纸片确证法一致性一般,其特异度也较低;对大肠埃希菌存在一定的假阴性,对于该显色平板上生长的绿色和白色菌落需要做进一步鉴定确认。     

奶糖的样品前处理优化与微生物检测结果影响因素相关性讨论

本文的主要研究目的是找到针对不同奶糖样品最适合的前处理方法、快速有效的检测方法以及影响检测结果的相关性因素。通过溶化温度、溶化方式、溶化时间等不同实验条件,找出了能满足不同奶糖菌落总数检测要求的样品前处理方法,即将25 g奶糖样品称取到预温至45℃的225 m L灭菌生理盐水中,在45℃气浴恒温振荡器中以220 r/min振荡11 min,使奶糖完全溶化。同时由于奶糖中有些菌落会蔓延生长,为了不影响计数结果,在倾入平板计数琼脂培养基冷却后再在其表面覆盖一层5 m L培养基抑制菌落蔓延,对抑制效果不佳的使用光学放大菌落计数器计数,以保证最终检测结果的准确性。不同奶糖中水分、营养含量及pH相差不大,实验结论表明与其菌落总数检测结果高低无相关性。通过36℃培养24 h与48 h菌落总数检测结果没有明显差异,可以将培养24 h的检测结果作为参考。     

平板菌落计数的改进方法

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液接种到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数和取样结合总量即可换算出样品中的含菌数。传统的平板菌落计数正是基于上述原理而进行的。     

微生物在水环境中的存活和生长

在灭菌自来水模拟水体中,研究了7种细菌的存活和生长规律。Klebsiella pneumo-niae,Enterobacter aerogenes,Agrobacterium tumefatciens,在7天内平板计数降至0,而水体中镜检细菌总数(AODC)和活菌直接计数(DVC)结果无大变化,说明细菌已变成活的非可培养状态。Micrococcus,flavus 和 Streptococcus faecalis 的可培养菌数也可降至0。Pseudomonas sp.在48小时内由10~5降至10~2cfu/ml,随即升至10~6 cfu/ml 并持续到实验终了(41天)。Bacillus subtilis 在48小时平板计数降至10~2cfu/ml 并维持在该水平至实验结束(38天)。研究结果表明仅用涂布平板法检测多种细菌在水环境中的生存和分布是不合适的。     

显色培养基在几种食源性致病菌快速检测中的应用*

用显色培养基鉴定微生物是一种新的微生物快速检测技术,该技术以生化反应为基础,通过在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物直接根据菌落颜色对菌种作出鉴定。常见食源性致病菌检测中,李斯特菌显色培养基(BCM^TMListeriamonocytogenes,Rapid’LMONOagar,CHROMagar^TMListeria)、大肠杆菌显色培养基(CHROMagarTMEcoli)、沙门氏菌显色培养基(Rambachagar)、金黄色葡萄球菌显     

大气压辉光放电低温等离子体诱变选育谷氨酰胺转胺酶高产菌株

以茂源链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)03-10为出发菌株,采用一种新型的裸露电极大气压辉光放电的冷等离子体技术对链霉菌孢子进行诱变。根据双层平板法菌落显色及诱变处理后菌落形态差异快速筛选谷氨酰胺转胺酶高产突变株。突变率、正突变率分别达到42.8%和20.6%。最后复筛选育出具有较好遗传稳定性和形态稳定性的高产突变株G2-1,酶活达到2.73U/mL,比出发菌株提高了82%。     

XTT四唑鎓盐试验快速检测卡介苗活性

卡介苗生产中最重要的质检指标—活菌含量测定 ,传统固体培养计数方法时间需 2 1天以上 ,且结果有时不稳定、操作复杂。使用XTT[2 ,3 bis (2 methoxy 4 nitro 5 sulphenyl) (2H) tetrazolium 5 carboxanilide]做底物的四唑钅翁盐试验在活卡介菌的还原下快速显色 ,很好地反映出卡介苗活菌的浓度差异。实验观察在微孔培养板中反应经酶标仪测定的XTT试验非常简便易行 ,不受死亡细菌的影响 ,不受培养基的影响 ,实验重复性非常好 ,检测活性单位时间惊人地缩短为 2 4小时左右 ,检测活性范围大。此方法有潜力代替传统活菌计数法用于卡介苗生产中的活性单位测定。     

产脑苷脂鸡枞菌Termitomyces clypeatus CTM-1的分子生物学鉴定及生长特性研究

脑苷脂A和B具有显著的镇痛作用和脑神经保护作用。鸡枞菌(Termitomyces clypeatus)子实体含有脑苷脂A和B,但是野生鸡枞菌子实体资源稀少。笔者在前期研究中以野生鸡枞菌子实体为原料,通过组织分离、菌种纯化及筛选,培育出菌株CTM-1。本研究中,采用分子生物学方法鉴定了菌株CTM-1与鸡枞菌的菌种同源性,测定了该菌株平板培养、液体培养中菌丝体的生长速率和脑苷脂含量。实验结果表明:菌株CTM-1及其出发野生子实体与Termitomyces clypeatus的同源性为99%。在PDAY平板培养中,菌落直径的增长速率在27 d内基本稳定在1.5mm/d。比菌落直径增长速率在1 d时为0.21 d-1,然后逐渐下降。在DPt液体培养中,9 d以后为菌丝体生长的稳定期,此时的生物量为3.57 g/L。比菌丝体生长速率在1 d时为2.00 d-1,然后逐渐下降。菌丝体的脑苷脂A、B含量分别为0.152%、0.066%。由此可见,鸡枞菌CTM-1的大规模培养可以成为脑苷脂A、B原料生产的有效途径。     

不同增菌和培养条件下沙门氏菌检出效果的比较

通过在鸡精样本中添加低含量的鼠伤寒沙门氏菌和干扰菌(弗氏柠檬酸杆菌和奇异变形杆菌),参考国标和美国药典中沙门氏菌的定性方法,研究比较了3种选择性增菌液、4个培养时间段以及4种选择性平板对于沙门氏菌的不同检出效果。结果表明,在RV肉汤及四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)中培养18 h～20 h,使用沙门显色培养基及亚硫酸铋琼脂(BS平板)进行选择性培养沙门氏菌的检出效果最好。     

转化医学真菌学实例——直接提取DNA鉴定菌种及体外药敏试验指导诊治面部难辨认癣

目的报道1例由万博节皮菌(趾间毛癣菌有性期)所致面部难辨认癣,取皮损鳞屑直接提取真菌DNA做菌种鉴定,并与真菌培养鉴定结果比较,对培养的菌落直接用抗真菌乳膏做药敏实验指导治疗。方法病变部鳞屑经KOH涂片真菌镜检阳性后,取鳞屑直接提取DNA,以真菌通用引物ITS1/4做PCR扩增后测序;同时从培养生长的菌提取DNA做分子生物学鉴定;并将抗真菌乳膏加入含菌平板孔中观察抑菌圈大小。结果鳞屑直接提取的DNA与培养获得菌落提取的DNA经PCR-测序均鉴定为万博节皮菌,诊断万博节皮菌感染所致面部难辨认癣。镜检阳性后即给予特比萘芬口服(250mg/d)及1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏外用,每周复诊并取鳞屑镜检和培养,基于药物抑菌实验结果指导治疗5周,至临床治愈和真菌培养转阴。结论鳞屑直接提取DNA做PCR-测序能及早明确菌种,待培养菌落长出后做PCR-测序验证,直接用成品抗真菌乳膏做体外药敏实验指导临床选药,动态培养鳞屑以确定疗程。此个体化诊治方案为从临床到实验室、从实验室到临床转化医学真菌学的成功实例。