植酸酶高产菌的诱变选育

以黑曲霉ＭＡＯ２１为出发菌株,经紫外线,、亚硝基胍单独处理和复合处理,获得一植酸酶高产菌株ＵＮ－１２－１０。该菌株具有稳定的遗传性能,在经过优化的摇瓶培养基上发酵１０８ｈ,其植酸酶活力达到２９５０－３０１５ｕ／ｍｌ,是原始出发菌株的３．６倍。     

植酸酶高产菌株的诱变选育

无花果曲霉是一种可以产植酸酶的菌株,其代谢产物植酸酶可以将有机植酸磷降解为无机磷。以此菌株为出发菌株,确定了它的最适pH值为1.3~1.4,最适温度为55~60℃。同时,为获得高酶活的突变株,进行亚硝基胍和紫外线处理,经初筛得到99株高效突变株,再经复筛和传代试验,得到1株植酸酶活性是出发菌株2.47倍的突变株NTG-23。     

CN—92植酸酶产生菌的诱变选育及产酶条件的研究

以无花果曲霉IFFI2227为出发菌株,通过NTGT和Co60复合诱变处理,获得5株产植酸酶活力比出发菌株高2．1～2．5倍的高产菌株。其中1株CN－92菌产酶性能稳定,研究了该菌株的最适产酶条件：培养温度30℃,培养基起始pH6．0培养时间72h。适宜于该菌株产植酸酶的优良固体培养基组成为：麸皮、豆饼粉、硫酸铵及少量无机磷,培养基含水率51％。葡萄糖、乳糖和MH4Cl、NH4NO3等不同程度地抑制植酸酶的合成,微量元素如Mn,Zn,Cu等对产酶无促进作用。     

中性植酸酶高产菌株的筛选及产酶条件研究

以地衣芽孢杆菌为原始出发菌株,用紫外线反复诱变,最终获得一株中性植酸酶高产菌株B.licheniformis LL8,其酶活性约为原始出发菌株的2倍。该菌株具有稳定的遗传性能。通过单因素试验和正交试验对发酵条件进行了优化,当培养温度为55℃,pH为7.5,接种量为10%时,经30h培养后,中性植酸酶活力最高达到2268.4U/mL。     

植酸酶产生菌黑曲霉N14的诱变选育及其基因分析

以植酸酶产生菌黑曲霉03214为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,获得了产酶活性较出发菌株提高了22．3％,达422IU／ml发酵液的突变菌株黑曲霉N14,其最适pH值为2．5,最适温度为50℃。通过对黑曲霉N14植酸酶phyA基因进行PCR扩增,获得了一条长约1．5kb的特异性产物。以pMD18-T为载体,构建了含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列测定表明,目的基因片段含有植酸酶phyA基因的完整序列(GenBank Accession：AY426977),phyA基因全长1506bp,其中包含一段长102bp的内含子,编码467个氨基酸,有10个潜在的糖基化位点,5’端有一编码19个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶基因工程菌的构建奠定了基础。     

高产植酸菌株的空气等离子体诱变选育

利用空气等离子体对植酸酶产生菌Aspergillus niget0002进行诱变选育,获得一株高产菌株,其酶活力是出发菌株的1．72倍。实验表明：应用廉价辐射源—空气等离子体诱变选育微生物切实可行。     

烟曲霉WY-1植酸酶基因的克隆及其在烟草中的表达

大连理工大学环境与生命学院生物工程系王严、高晓蓉、苏乔等生物工程科研工作者以自行筛选的烟曲霉WY-1为出发菌株。通过PCR方法克隆其植酸酶基因，并构建了含有植物信号肽序列的植酸酶基因植物表达载体。他们利用农杆菌介导的叶盘法对烟草叶片进行了遗传转化。     

产植酸酶菌株的分离筛选研究

研究了产植酸酶菌株分离筛选的方法 ,筛选得到分别适宜液态发酵和固态发酵的酶活力较高的黑曲霉XH和黑曲霉PA两菌株。在液态发酵KH2 PO4 对植酸酶产生有促进作用 ,其最佳用量为 8mg %;在固态发酵KH2 PO4 的添加对植酸酶的产生无明显促进作用。 2菌株所产植酸酶具有相似的酶学性质 ,最适作用温度为 5 5℃ ,当底物 pH为 3～ 5具有较高的酶活力。     

表面展示表达植酸酶的重组酿酒酵母构建及酒精发酵

以淀粉为原料的同步糖化发酵是目前乙醇生产的主要途径之一。然而原料中含有的植酸不仅影响酒精发酵效率,而且也会导致环境中难以被植物吸收的磷含量的增加,加剧环境污染。将来源于大肠杆菌的植酸酶基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接并置于α-因子分泌信号肽下游,构建植酸酶表面展示表达重组载体pMGK-AG-phy并转化工业酿酒酵母,成功获得了在细胞表面锚定表达植酸酶的重组菌PHY。重组酵母的植酸酶表达水平达到6.4 U/g(菌体湿重),其最适温度为55℃,最适pH 4.0,在pH 3.5–4.5范围内具有较高的活性。以玉米粉为原料的同步糖化发酵实验表明,重组酵母PHY的生长速度高于出发菌株,同时酒精产量相较于出发菌株提高了3.7%。更为重要的是发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了91%。构建的表面展示表达植酸酶的重组工业酿酒酵母能够有效降低植酸含量,提高了酒糟的利用价值,减少磷排放,对燃料酒精的环境友好生产具有重要的借鉴意义。     

文摘

产植酸酶的黑曲霉菌株筛选及其植酸酶基因克隆［中］／姚斌…／／农业生物技术学报．－１９９８,６（１）．－１～６从土壤中筛选到产植酸酶的黑曲霉菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ９６３,对其所产植酸酶的生理生化性质研究表明具有适合于在饲料中使用的优良性质...     

易错PCR技术提高黑曲霉N25植酸酶活力的研究

利用易错PCR技术对黑曲霉(Aspergillus niger)N25的植酸酶基因phyA进行定向进化研究,突变基因产物重组于表达载体pET32a(+)中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,经筛选获得了最佳突变菌株pET32a-phyAep,其植酸酶活力比出发酶提高了41.8%。突变酶的酶学性质研究发现,与野生酶相比,它的热稳定性,最适温度和最适pH值无显著变化。     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。     

卡氏德巴利酵母植酸酶在毕赤酵母中的异源表达及优化

【背景】植酸是一种能螯合金属离子和蛋白质的有机磷类化合物,广泛存在于植物组织中,影响动物对营养元素的吸收。在饲料中加入植酸酶可有效降解植酸。【目的】构建毕赤酵母异源表达卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castellii,D. castellii)植酸酶的菌株,促进卡氏德巴利酵母植酸酶的研究及工业应用。【方法】将卡氏德巴利酵母植酸酶基因进行密码子优化后转入毕赤酵母GS115中,通过筛选多拷贝、敲除蛋白酶、过表达分子伴侣及转运蛋白的方法获取优势菌株。【结果】所得重组菌株GS115/DCphy(ΔPep4)(BFR2)的产酶酶活是低拷贝菌株的7倍。【结论】研究结果为卡氏德巴利酵母植酸酶的异源表达及潜在工业应用提供了一定的指导。     

植酸酶固体发酵条件的研究

黑曲霉Ｇ２.１．１．１．４菌株在产生植酸酶时受无机磷的反馈阻遏,并且植酸酶的产生与淀粉酶的产生存在相互抑制。对植酸酶固体发酵进行调控和通过响应面分析优化发酵条件,提高了植酸酶产量。最适发酵条件下,植酸酶（ＰｈｙｔＡ）的产量可达６２．１ｕ／ｇ．干基。     

毕赤酵母中植酸酶和内切葡聚糖酶共表达菌株的构建及其高效表达(英文)

植酸酶和内切葡萄糖苷酶广泛应用于动物饲料添加剂中,能更有效地帮助饲料的利用,同时为动物的生命活动提供必需的重要物质。首先构建重组质粒pPICZα-EG,经过线性化后,电转化到含有植酸酶phyA基因的毕赤酵母感受态细胞中,构成含有植酸酶基因和内切葡萄糖苷酶基因的重组体菌株GS115-phyA-EG。经甲醇诱导后其活性分别达到出发菌株GS115-phyA和GS115-EG的39.4%和56.2%。酶学性质的分析显示,最适反应温度和最适反应的pH值分别为55℃和5.5,植酸酶和内切葡萄糖苷酶在温度为45℃~55℃,pH值为4.5~5.5时,酶活相对稳定,均能达到最高酶活的80%以上。结果表明这种在同一个系统种同时表达2种酶的方法能更好地节约时间和成本,使其在饲料工业的应用上有更广阔的前景。     

植酸酶菌种筛选方法的研究

通过微板培养法对植酸酶产生菌菌种筛选方法进行了研究,建立了一种快速、有效的高通量植酸酶菌种筛选方法。利用该方法结合菌种诱变技术已选育出植酸酶酶活高达297u／mL的A,niger 496-1菌株。     

细菌耐热植酸酶基因的克隆及表达*

设计筛选培养基,从203株细菌菌株中筛选到四株可以分解植酸的菌株：SD01N,SD01X,SD01B和SD01D,设计植酸酶基因特异性引物P1和P2,分别以这四株菌的基因组DNA为模板进行扩增,其中菌株SD01N出现一条明显的扩增条带,大小约1．2kb。对PCR产物进行序列分析表明,该片段含有一个编码383个氨基酸的开放阅读框架。将该片段与载体pQE-30连接后转化大肠杆菌M15,得到重组菌株SDLiuTP01,对该菌株进行培养,经IPIG诱导基因表达,与携带空载体菌株相比较,在菌株SDLiuTP01中可检测到植酸酶活力。对重组菌株的植酸酶活力考察表明,该酶在25℃～95℃温度范围均具生物活性,最适反应温度为75℃,属于耐热性植酸酶。在各pH缓冲系统中反应结果,酶活力出现两个较高值,分别为pH4．6和pH7．5。     

植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母po1h中的表达

本实验通过PCR方法从毕赤酵母GS115-phyA中扩增出不含有信号肽及内含子的黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因,并将其克隆到表达载体pINA1297中,得到表达载体pINA1297-phyA,利用醋酸锂转化法将线性化载体转化到解脂耶氏酵母po1h中,通过YNBcasa和PPB平板筛选出阳性表达菌株,阳性菌株在YM培养基中28℃培养6d后酶活达到最大为636.23U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130kDa,但通过去糖基化处理后其分子量变为51kDa,与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃,该酶在pH2.0~8.0处理1h后仍有较高酶活,并且90℃处理10min后还有86.08%的残留酶活,其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα, 插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m 。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×10⁶IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到1.2×10⁷IU/mL发酵液以上, 较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。     

高寒草地燕麦根际解植酸磷促生菌鉴定及其优势菌假单胞菌属菌株功能特性

旨为从高寒草地燕麦根际定向筛选解植酸磷微生物资源，筛选促生潜力菌株，分析植酸酶编码基因。采用国际植物研究所磷酸盐生长培养基（NBRIP）分离及筛选菌株，16S rRNA基因鉴定其分类地位，并测定菌株植酸酶活性及促生特性，结合简并PCR和高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)扩增植酸酶基因完整序列，并进行生物信息学分析及异源表达。共获得107株菌株，其中51株能在NBRIP培养基上形成清晰溶磷圈，鉴定为2门10科11属，以假单胞菌（Pseudomonas）为优势菌。14株不同种假单胞菌均检测出植酸酶活性，具有溶解有机/无机磷、分泌IAA(3-indoleacetic acid)、固氮及拮抗植物病原菌的促生活性。获得了3株菌株的植酸酶（PHY65、PHY101和PHY131）序列，预测为β-螺旋植酸酶（β-propeller phytases,BPPhy）家族蛋白，其中重组PHY65的比活性为28.2 U/mg。研究结果可为解磷生物菌剂的研发与利用提供优良菌株资源，为植酸酶的生产应用提供理论基础。