一色齿毛菌对百菌清的生物降解研究

为了验证白腐真菌对杀菌剂——百菌清的降解能力,并初步探讨其降解机制,以平皿培养方式对70株白腐真菌菌株降解百菌清的能力进行验证和筛选,并选择降解作用突出的一色齿毛菌Cerrena unicolor Y4941进行液体培养条件下对百菌清的降解。结果表明:卵菌杀菌剂没有对测试的白腐真菌产生抑制或杀灭作用,在所筛选的70株菌株中,一色齿毛菌Cerrena unicolor Y4941、硬毛粗盖孔菌Funalia trogii W4289、桦褶孔菌Lenzites betulina Y4962、藏红硬孔菌Rigidoporus crocatus D10146、裂褶菌Schizophyllum commune D9466和云芝栓孔菌Trametes versicolor W4614等菌株都对百菌清显示出较强的降解能力;对一色齿毛菌Cerrena unicolor Y4941在液体培养条件下降解百菌清研究的实验结果表明,活菌(living culture,LC)降解率粗酶液(crude enzyme liquor,CEL)降解率灭活菌丝体(devitalized mycelia,DM)降解率,经过活菌降解3d的样品中百菌清的残留率仅为1.92%;对培养液中漆酶活性测定结果显示,漆酶活性最高可达2 195.55U/L。上述证明,杀菌剂百菌清不对白腐真菌产生抑制或杀灭作用,相反,一色齿毛菌Cerrena unicolor Y4941等菌株对其有很强的降解能力,在杀菌剂生物降解领域有潜在的应用前景。     

一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其粗酶性质研究

利用平板透明圈法,筛选分离到37株具有阿魏酸酯酶活性的丝状真菌,其中1株编号为HA4087的菌株具有较强的产阿魏酸酯酶能力。经形态学观察、18S rDNA和ITS序列鉴定为互隔交链格孢霉。对该菌株所产阿魏酸酯酶的粗酶性质进行了初步研究,结果表明,在发酵培养基中发酵粗酶活力为86 mU/mL,最适作用温度为55℃,最适pH值为5.5;在55℃保温30 min后酶活力仍为90%以上;在pH4.5-6.5范围内稳定性较好,酶活仍为85%以上。试验获得了产高酶活阿魏酸酯酶的菌株,为阿魏酸酯酶的工业化应用提供前提。     

白腐真菌染料脱色菌株的筛选及一色齿毛菌脱色条件的研究

以平皿培养方式对采集自中国和芬兰的白腐真菌菌株降解6种不同结构的人工染料的能力进行了筛选研究。在40株菌株中,黑管孔菌Bjerkandera adusta Y5012,一色齿毛菌Cerrena unicolor Y5002,硬毛粗盖孔菌Funalia trogii Y4997,香栓孔菌Trametes suaveolens D8325和云芝栓孔菌Trametes versicolor Y4946对刚果红、橙黄G、茜素红、结晶紫、中性红和亚甲基蓝均显示出较强的脱色能力。对一色齿毛菌Cerrena unicolor Y5002的液体培养脱色条件进行了研究,其最适碳源和氮源分别为蔗糖和麦芽浸粉;在不同橙黄G浓度下均获得较高的脱色率,因此浓度为500mg/L的橙黄G未对该菌的脱色能力产生抑制作用,而浓度为400mg/L茜素红则对其脱色作用产生明显抑制。对菌丝生物量和染料脱色率的研究表明,在不同碳源和氮源条件下,两者之间具有明显的正相关性。     

从白腐菌中筛选漆酶高产菌株的初步研究

从中国分离的149株木腐菌中,有30株具有漆酶活性。在添加了阿魏酸的液体培养基中,漆酶产量高(每升培养液中漆酶含量在10000单位以上)的菌株有9个:游离细胞培养的彩绒革盖菌Coriolus versicolor G30,相邻小孔菌Microporus affinis G07,血红密孔菌Pycnoporus sanguineus W006,W006-2,W3008,G05和香菇Lentinus edodes G18,以及固定细胞培养的鲑贝革盖菌Coriolus consors 98563和干酪菌Tyromyces sp. 98420。彩绒革盖菌、相邻小孔菌和血红密孔菌具有重要的生物工程研究价值。     

一色齿毛菌漆酶的酶学特性及染料脱色研究

染料由于具有复杂的化学结构通常难以降解。本文从白腐菌一色齿毛菌LS0547中纯化出胞外漆酶并用于染料脱色实验。SDS-PAGE结果显示纯化的漆酶分子量大小为63.7kDa。漆酶氧化底物ABTS的最适pH为2.2,最适温度为50℃。叠氮钠可强烈抑制漆酶活性,半胱氨酸和二硫苏糖醇可部分抑制漆酶活性。漆酶氧化ABTS,丁香醛连氮和2,6-二甲氧基苯酚的米氏常数分别为0.217,0.306和0.199mmol/L。粗酶和纯化的漆酶用于不同化学结构的染料的脱色研究,结果表明一色齿毛菌纯化漆酶可快速对RB亮蓝进行脱色,偶氮胭脂红和结晶紫的脱色效果低于RB亮蓝,测试的三种染料均可在没有介体存在的条件下被漆酶脱色,显示出一色齿毛菌漆酶在染料废水处理中的应用前景。     

栓孔菌属漆酶高产菌株的初步筛选及其产酶条件的优化

利用显色反应对栓孔菌属(Trametes)进行了漆酶高产菌株的筛选,并对目标菌株的产酶条件进行了优化,在添加愈创木酚的固体培养基中,通过显色反应初步筛选出漆酶高产菌株东方栓孔菌Trametes orientalis Cui 6300;进一步通过单因子分析、正交试验和ABTS法确定了菌株Cui 6300的最适产酶条件:麦芽糖15 g/L,蛋白胨3 g/L,pH 4.8,Cu2+2.0 mmol/L,培养温度28°C,接种饼直径1.5 cm,此时酶活最高可达19.923 U/mL;同时探索了Cu2+浓度及添加时间对其菌丝生物量和漆酶活力的影响。研究表明,Cu2+最适添加浓度为2.0 mmol/L,添加时间为接种后第3天。     

血红密孔菌高产漆酶菌株的筛选及其对烟梗的生物降解

白腐菌是目前已知的唯一能将木质素彻底降解的微生物,而漆酶在木质素分解过程中起着重要的作用,被广泛应用于农作物秸秆或甘蔗渣等多种类型生物质的生物预处理和生物降解。本研究利用白腐菌产漆酶发酵培养基对30株血红密孔菌Pycnoporus sanguineus菌株进行筛选,得到了多株漆酶高产菌株,并研究了血红密孔菌发酵粗酶液和菌丝对烟梗的生物降解条件。研究结果表明:血红密孔菌及其产生的漆酶表现出了对烟梗木质素较强的生物降解能力。在漆酶浓度为40U/mL、温度30℃、pH4.5的条件下处理24h,烟梗中木质素的降解率可达到50.4%,纤维素和半纤维素的降解率分别为17.5%和17.3%;漆酶浓度为5U/mL、温度30℃、pH4.5的条件下处理48h,木质素降解率可达到65.1%。血红密孔菌菌丝也表现出对烟梗较好的生物降解效果,接种培养7d后烟梗中木质素降解率可达30%以上,21d后木质素的降解率可达79.1%,而纤维素和半纤维素的降解率仅为20%和12%左右。本研究不但为生物质材料的生物预处理和生物降解提供了优质的白腐菌及漆酶资源,还为通过烟梗的生物预处理提高烟草梗丝和卷烟品质提供了重要参数,具有一定的应用前景。     

1株阿魏酸酯酶产生菌的筛选鉴定及发酵条件优化

从浙江绍兴鉴湖附近土样中分离筛选到1株产阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase,FAE)的菌株FD-8,通过菌落形态、分生孢子梗形态对比和ITS/18S rDNA分子生物学同源性分析,鉴定该菌株为溜曲霉,命名为Aspergillus tamarii FD-8。FD-8生长最适碳源和氮源分别为蔗糖和酵母浸提物,最适生长温度和pH分别为32℃和5.0,最适产酶条件为32℃、pH 6.0,发酵周期为120 h。在最适培养基中、分阶段控制pH培养条件下,FAE比酶活达到231.34 mU/mg。去淀粉麸皮可诱导FAE的合成,在发酵48 h添加20.0 g/L去淀粉麸皮,FAE最高比酶活可达到573.61 mU/mg,比对照提高1.48倍。     

黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。     

来自桔青霉的阿魏酸酯酶的分离纯化、理化性质

【目的】从桔青霉的发酵液中分离纯化了胞外阿魏酸酯酶(PcFAE)并进行了酶学性质的研究,初步探讨了PcFAE对麦糟的酶解作用。【方法】利用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Phenyl Sepharose6Fast Flow疏水层析纯化得到电泳纯的阿魏酸酯酶。【结果】从该菌株的发酵液中获得一阿魏酸酯酶,该酶亚基分子量约为31kDa,全酶分子量约为58kDa。其最适pH为6.0,最适温度为45℃-65℃,在pH5.0-6.0及25℃-55℃之间,酶保持了较好的稳定性。Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+和Na+对酶活有一定的促进作用,Zn2+对PcFAE酶活有一定的抑制作用,而Cu2+、亮抑肽素、抑肽酶有显著的抑制作用,Hg2+、苯甲基磺酰氟几乎完全抑制了酶活。EDTA对PcFAE活性无明显影响。PcFAE的kcat/Km对香豆酸甲酯、芥子酸甲酯、阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯的值分别为823、416、103、0,PcFAE对MpCA的催化效率最高。PcFAE作用于麦糟,当5U PcFAE/g麦糟时,其阿魏酸的释放量为7.2%。【结论】获得了一阿魏酸酯酶,其理化性质与至今报道的阿魏酸酯酶有所不同,为阿魏酸酯酶的开发提供了重要的实验依据。     

产漆酶菌株分离及发酵条件优化

[目的]筛选高产漆酶菌株。[方法]利用愈创木酚-PDA平板筛选高产漆酶菌株,单因素实验确定最佳产酶条件。[结果]筛选到一株高产漆酶菌株,编号QMJZ-5。结合形态观察和5.8S rDNA-ITS序列分析,确定该菌株是血红密孔菌(Pycnoporus coccineus),优化发酵培养基:甘油20 g/L,豆粕6.0 g/L,香兰素0.15 g/L,阿魏酸0.15 g/L,KH₂PO₄1.0 g/L,Na₂HPO₄·12H₂O 0.2 g/L,CuSO₄·5H₂O 1.5 mmol/L,初始pH 5.0,30℃,发酵8 d,产酶55 U/m L。[结论]筛选到1株高产漆酶菌株。     

从白腐菌中筛选漆酶高产菌株的初步研究

从中国分离的149株木腐菌中,有30株具有漆酶活性,在添加了阿魏酸的液体培养基中,漆酶产量高（每升培养液中漆酶含量在10000单位以上）的菌株有9个,游离细胞培养的彩绒革盖菌Coriolus versicolor G30,相邻小孔菌Microporus affinis G07,血红密孔菌Pycnoporus sanguineus W006,W006-2,W3008,G05和香菇Lentinus edodes G18,以及固定细胞培养的鲑贝革盖菌Coriolus consors 98563和干酪菌Tyromyces sp.98420。彩绒革盖菌,相邻小孔菌和血红密孔菌具有重要的生物工程研究价值。     

两株保加利亚乳杆菌产β-半乳糖苷酶条件的优化及酶活力测定

目的优化2株保加利亚乳杆菌产β-半乳糖苷酶的培养条件,测定其在最适于产酶条件下的酶活力,并初步观察酶活力稳定性。方法测定2株保加利亚乳杆菌——来源于酸奶的wch9901和标准菌株1．1480在不同培养时间、培养基碳源、摇床转速、气体环境下产生的β-半乳糖苷酶的活力,优化产酶条件。测定2株菌在其最适产酶条件下的酶活力。将制得的1．1480粗酶液分别置冰浴和20℃水浴,每隔1h测定一次粗酶液中β-半乳糖苷酶活力,观察酶活力稳定性。结果2株保加利亚乳杆菌的最适产酶条件分别为：1．1480于30℃有氧静止培养36h;wch9901于37℃厌氧静止培养18h,培养基含乳糖。在最适产酶条件下,1．1480的酶活力为0．321NLU／ml粗酶液,比酶活为2．469NLU／mg蛋白;wch9901的酶活力为0．401NLU／ml粗酶液,比酶活为6．169NLU／mg蛋白。1．1480粗酶液于冰浴可稳定保存6h,于20℃水浴可稳定保存5h。结论wch9901与1．1480的最适产酶条件有所差异,前者产酶迅速,产酶量多。     

一色齿毛菌对刚果红的脱色优化及其毒性变化研究

一色齿毛菌Cerrena unicolor是分离自野外的一株能够降解木质素的白腐真菌。为明确一色齿毛菌对染料的脱色能力及脱色前后染料毒性的变化,本研究利用一色齿毛菌对固体条件下4种染料进行脱色能力的检测,筛选出较易脱色的染料后,对该染料的脱色条件进行优化,并以3种豆类发芽率为指标测定该染料脱色前后的毒性变化。结果表明,一色齿毛菌对4种染料均可脱色,其中对刚果红的脱色效果最为明显;一色齿毛菌对刚果红脱色条件的优化结果为：20g/L麦芽糖,1g/L硝酸铵,1mmol/L硫酸镁,接种9块直径1cm菌饼,10mg/L染料浓度,pH 7时脱色效果最好;刚果红染料脱色前后毒性测试结果显示：染料脱色前发酵液毒性>染料脱色后发酵液毒性>清水处理毒性,表明刚果红染料存在一定的毒性,但在被一色齿毛菌脱色后,染料毒性有所降低。本研究为一色齿毛菌在染料废水脱色方面的应用及降低染料废水毒性提供一定的参考依据。     

一株产胆固醇氧化酶的不动杆菌的筛选鉴定及特性研究

目的：筛选鉴定产胆固醇氧化酶的菌株并对其酶的性质及发酵条件进行初步的研究。方法：利用唯一碳源的胆固醇平板筛选,酶活测定比较得酶活力最高的菌株;生理生化试验结合16S rDNA序列分析鉴定其种属,单因素及正交实验优化培养基及发酵条件。结果：所得菌株H4与产不动杆菌（Acinetobacter）有最近的亲缘关系,其胆固醇氧化酶作用的最适温度和pH分别为37℃和8.0,金属离子Mg2＋、Zn2＋、Fe2＋对该酶具有一定激活作用,菌株产酶的最适培养基为（g/L）：胆固醇1.5,蔗糖5,蛋白胨7,硝酸铵3,吐温1.0,pH7.5;最适培养条件为33℃,15mL培养基/100mL三角瓶,摇床培养（200r/min）48h,优化后发酵液酶活达135.8U/L。结论：获得了1株产胆固醇氧化酶的菌株H4,并初步鉴定为不动杆菌（Acinetobacter）。     

阿魏酸酯酶A的基因克隆与表达及其水解产物的纯化

为在毕赤酵母中表达来源于米曲霉Aspergillus oryzae的A型阿魏酸酯酶并研究其水解功能,探讨大孔树脂对其水解产物阿魏酸的纯化条件及纯化效果,以米曲霉A.oryzae CICC 40186总RNA为模板,通过RT-PCR技术克隆出了米曲霉阿魏酸酯酶A(AorFaeA)成熟肽的编码基因AorfaeA,并借助pPIC9K质粒实现了其在毕赤酵母GS115中的异源表达。SDS-PAGE分析结果显示纯化后的重组阿魏酸酯酶(reAorFaeA)为单一条带,其表观分子质量约39.0 kDa。以阿魏酸甲酯为底物,经高效液相色谱法测得该酶的最高酶活为58.35 U/mg。利用reAorFaeA和木聚糖酶复合酶水解去淀粉麦麸制备阿魏酸,用大孔树脂纯化小麦麸皮阿魏酸粗提液,所测树脂中HPD-300型大孔树脂的吸附量和解吸率较高,以50%的乙醇为洗脱液,当流速为1.0 mL/min时洗脱效果较好。在该纯化条件下,阿魏酸的回收率为92%,质量分数由原材料中的0.13%富集提高到10.55%。这些研究为阿魏酸的酶法"绿色生产"及应用奠定了坚实的理论基础。     

一株高产纤维素酶菌的筛选与鉴定

利用刚果红脱色从森林腐木中筛选到一株高产纤维素酶菌,结合18S rRNA基因序列分析和菌株形态特性分析,确定该菌株为爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum).通过研究粗酶提取时不同离心时间和离心转速对酶活的影响,确定采用3000r/min,15min离心条件下获得的粗酶测定CMC酶活,采用4000r/min,10min的离心条件下获得的粗酶测定FPA酶活和β-葡萄糖苷酶活.酶学性质初步研究显示,纤维素酶反应的最适pH值以5.0为宜;CMC酶最适酶解温度和酶解时间为60℃,15min;FPA和β-葡萄糖苷酶最适酶解温度和酶解时间均为50℃,20min.     

黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】对黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶基因进行克隆和密码子优化,使其在毕赤酵母(Pichia pastoris X-33)中高效表达。【方法】以黑曲霉基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(Anfae A),并对Anfae A基因进行毕赤酵母密码子偏好性"随机优化"和"一对一优化",全基因合成后分别与表达载体pPICZαA连接,构建表达载体pPICZαA-Anfae A、pPICZαA-op Anfae A I和pPICZαA-op Anfae A II。经Sac I线性化后电转化至P.pastoris X-33中,筛选阳性转化子。摇瓶发酵4.5 d后,测定并比较重组阿魏酸酯酶(re Anfae A)酶活。【结果】密码子优化前阿魏酸酯酶酶活为6.8±0.1 U/m L,基因"一对一优化"和"随机优化"后的重组酶酶活分别为5.2±0.1 U/m L和39.9±0.1 U/m L,"随机优化"后酶活比优化前提高了近6倍,而"一对一优化"后酶活仅为优化前酶活的76.5%。重组阿魏酸酯酶的最适p H为5.5,且在pH 4.5-7.0稳定性较好;最适反应温度50°C,在45-50°C较稳定。【结论】阿魏酸酯酶基因经密码子"随机优化"后进行重组表达,酶活显著提高,对研究阿魏酸酯酶在毕赤酵母及其它宿主中的高效表达具有一定的借鉴意义,也为大规模工业化应用奠定了基础。     

一株产乙酰酯酶细菌筛选、鉴定及酶学性质研究

【目的】利用筛选培养基,从肉牛瘤胃液中分离筛选产乙酰酯酶的细菌菌株,并研究菌株的产酶特征。【方法】利用厌氧培养技术,以木质素为唯一碳源,筛选并驯化所得菌株。根据菌株16S rDNA序列分析、革兰氏染色、伊红美蓝培养基培养、甲基红试验和柠檬酸盐利用试验,鉴定菌株。采用对-硝基苯乙酯测定酶活力。【结果】筛选得到产乙酰酯酶活力较高细菌菌株RB1,初步鉴定为Escherichia coli。菌株RB1的生长曲线表明,0 42 h为菌株的延迟期,42 60 h为菌株的对数期,60 66 h为菌株的稳定期,66 86 h为菌株的衰亡期。菌株所产乙酰酯酶最适温度为40°C,最适pH为8.0,在最适温度与pH条件下,培养基中添加玉米秸秆粉,乙酰酯酶最高酶活力达到0.52 U/mL。【结论】筛选获得产乙酰酯酶的细菌菌株RB1,其乙酰酯酶活力高于已报道的菌株,是一株具有研究和应用潜力的产乙酰酯酶的菌株。     

一组厌氧真菌菌系产阿魏酸酯酶的初步研究

利用玉米秸秆粉为唯一碳源的筛选培养基,从肉牛瘤胃液中筛选构建了一组厌氧真菌菌系,研究了该菌系产阿魏酸酯酶的特征.阿魏酸酯酶的最适pH为8.0,最适温度为40℃,最高酶活力为19.1 mU/mL,在pH 6.0 ～8.0及35～45℃之间,酶活性保持相对稳定.Mg2+对酶活力具有激活作用,Fe2、Cu2+、Fe3+等均抑制酶活力.