肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的表达

为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结合能力,在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究,表达产物均以包涵体形式存在;对复性后的单链抗体以细胞ELISA及竞争抑制流式细胞仪法进行检测,表明人源化单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是：在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDR的天然构象,表达的人源化单链抗体提供了免疫原性评价及临床应用的基础。     

肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及大肠杆菌中的表达

为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结构能力,在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究,表达产物均以包涵体形式存在;对复性后的单链抗体以细胞ＥＬＩＳＡ及竞争抑制流式细胞仪法进行检测,表明人源化单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是：大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设     

两种人源化单链抗体-尿激酶融合基因的构建与表达

Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ是单链尿激酶 (Ｓｃｕ ＰＡ)分子的Ｎ端肽段被水解后的产物 ,其分子量小但具有与Ｓｃｕ ＰＡ相同的体内外生物活性[1] 。在过去的工作中 ,本实验室利用噬菌体表面呈现技术筛选到 1株对人纤维蛋白特异的鼠源单链抗体[2 ] ,并构建了鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体—Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ融合基因。为解决该融合基因在大肠杆菌中的高表达问题 ,通过在大肠杆菌中表达构建的一系列融合基因的缺失突变体 ,初步认定Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ基因中两个连排的大肠杆菌稀有密码子ＡＧＧ(精氨酸 )是影响该融合基因表达的主要因素。用ＰＣＲ定位诱变法…     

人源抗狂犬病毒单链抗体基因原核表达质粒的构建及高效表达

在原核系统中高效表达抗狂犬病毒单链抗体scFv41,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景。以重组质粒pCANTABscFv41为模板,PCR扩增带NcoI和NotI位点的scFv41基因,克隆入原核表达载体pET-22b( ),酶切鉴定重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。竞争ELISA检测表达蛋白的特异结合活性。酶切鉴定证实scFv41基因已插入原核表达载体pETl-22b( ),重组表达质粒pET-scFv41在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达量约占菌体蛋白总量的30％。竞争ELISA检测结果表明scFv41表达蛋白可特异抑制抗狂犬病毒IGY与狂犬病毒的特异性结合。该实验为进一步研究scFv41的生物学特性和免疫保护作用,及基因工程抗体的制备奠定了基础。     

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。     

抗CEA单链抗体与链亲和素融合基因的表达

克隆分泌CEA杂交瘤细胞重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）,以Linker连接V_H及V_L构建抗CEA单链抗体.同时以Spacer连接单链抗体和链亲和素,构建成功单链抗体和链亲和素融合基因,克隆该融合基因至原核表达载体,pET21a(+),经IPTG诱导表达出该双特异性融合蛋白.活性鉴定表明该融合蛋白具有结合CEA及生物素的双特异性.该融合蛋白在生物领域中有较广阔的应用前景.     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的克隆与表达

为探讨肝癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因的表达策略并比较二者的结合能力,在3种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究;对复性后的单链抗体以抗原捕获ELISA法进行检测。结果表明,在3种载体中表达的鼠源及人源化单链抗体都是包含体,诱导物浓度及培养温度不影响表达形式;抗原捕获细胞ELISA表明人源化的单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDRs的天然构象,表达的人源化单链抗体提供了免疫原性评价及临床应用的基础。     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达

尿激酶是目前临床上广泛使用的一种有效的溶栓制剂 ,但由于尿激酶缺乏对血栓的特异亲和性 ,导致临床上尿激酶的使用剂量较大 ,容易出现全身性出血等副作用。因而开发对血栓特异的导向溶栓制剂是目前溶栓药研制的一个重要方向。本实验室在以前的工作中 ,利用噬菌体表面呈现技术 ,筛选到一种对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体[1 ] ,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上[2 ] ,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟 ,得到亲和力和特异性较鼠抗体更好的人源化单链抗体[3 ] 。为研制导向溶栓制剂 ,本实验室构建了人源化单链抗体 低分子量尿激酶的…     

牛蛙胃肠胰系统内分泌细胞的免疫组织化学鉴定与定位

应用过氧化物酶标记的链霉卵白素(S-P)免疫组织化学方法对牛蛙(Rana catesbeiana)胃肠胰系统5种内分泌细胞进行了鉴定与定位.在消化道中检测到了5-羟色胺(5-HT)、生长抑素(SS)、胃泌素(Gas)和胰高血糖素(Glu)细胞.5-HT细胞主要分布于胃幽门部和空肠,食道中偶见.SS细胞主要分布于胃,幽门部较密集,小肠各段少量,直肠和食道偶见.Gas细胞主要分布于小肠各段,胃和直肠中偶见,食道中未检测到.Glu细胞主要分布于胃和直肠,小肠各段偶见,食道中未检测到.在胰腺中检测出了5-HT、SS、Gas、Glu和胰多肽(PP)细胞.SS、Glu和PP细胞数量较多,成簇分布于胰岛中,5-HT和Gas细胞少量,散在分布于胰腺腺泡之间.胃腺部和胰腺内分泌细胞多呈圆形、椭圆形或形态不规则,有的可见明显胞突伸向邻近细胞,胃肠道上皮中的内分泌细胞多呈梭形、楔形或锥形,有的可见明显胞突伸向消化腔.与其它两栖动物相比,牛蛙胃肠胰系统内分泌细胞的存在与分布有一些共性,也存在着种间差异.     

Glycoconjugate localization in larval and adult skin of the bullfrog, Rana catesbeiana: a lectin histochemical study

This study investigates whether or not the distribution of specific glycoconjugates within the skin is related to the regulation of water balance in the aquatic larvae and semiaquatic adults of the bullfrog, Rana catesbeiana. A lectin histochemical study was carried out on paraffin sections of dorsal and ventral skin from tadpoles in representative stages as well as from adult frogs. Sections were stained with the following horseradish peroxidase (HRP)-conjugated lectins, which bind to specific terminal sugar residues of glycoconjugates: UEA 1 for alpha-L-fucose, SBA for N-acetyl-D-galactosamine, WGA for N-acetyl-B-D-glucosamine, and PNA for beta-galactose. Results indicate that lectins serve as markers for specific skin components (e.g., a second ground substance layer within the dermis was revealed by positive UEA 1 staining). Moreover, each lectin has a specific binding pattern that is similar in dorsal and ventral skin; the larval patterns change as the skin undergoes extensive histological and physiological remodeling during metamorphic climax. These findings enhance our understanding of glycoconjugates and their relationship to skin structure and function-in particular, to the regulation of water balance in R. catesbeiana.     

牛蛙致病变形菌的鉴定及其敏感药物筛选

【目的】分离鉴定引起牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤溃疡病症的致病菌,筛选抗菌药物。【方法】采用无菌解剖组织划线分离法分离致病菌,通过人工感染试验、菌体和菌落形态观察、API20E系统鉴定、16S r RNA基因序列分析,确定分离菌的致病性及分类地位,并对该菌进行药物敏感性试验。【结果】从患病濒死牛蛙体内分离细菌NWG20141026,通过形态特征观察、生理生化试验、API 20E系统鉴定和16S r RNA基因序列相似性分析,认为NWG20141026菌株为普通变形菌(Proteus vulgaris)。人工感染试验显示,NWG20141026菌株不仅可以通过皮肤伤口感染引起蛙体表溃疡溃烂病症,也可通过消化道感染引起蛙肠炎病。药敏实验结果表明,氟苯尼考、四环素、多西环素、萘啶酸、磺胺异噁唑、恩诺沙星、红霉素等7种药物对普通变形菌具有较好的抑杀菌作用。【结论】引起牛蛙(R.catesbeiana)皮肤溃疡病症的致病菌NWG20141026为普通变形菌(P.vulgaris),所患疾病命名为牛蛙变形菌病。普通变形菌对健康牛蛙具有较强致病性,氟苯尼考、四环素、多西环素、萘啶酸、磺胺异噁唑等5种药可作为防治牛蛙变形菌病的候选药物。     

浙江东部牛蛙的自然种群及潜在危害

牛蛙(Rana catesbeiana)的入侵已成为一些本地两栖类种群数量下降或灭绝的主要因素之一。1959年牛蛙被引入中国大陆,但直到1990年才开始在国内大范围饲养。牛蛙的自然种群在国内一直未见报道。我们于2003年9—11月调查了浙江省东部5区3县的牛蛙种群,发现在岱山、秀山、六横及佛渡岛上有牛蛙分布,共捕获23只牛蛙,包括4只成年个体,18个亚成体和1只蝌蚪。于2004年1月和2月在岱山捕获28只蝌蚪。结果显示：(1)牛蛙的蝌蚪能在当地越冬成活,说明牛蛙在上述4岛成功地建立了自然种群;(2)牛蛙主要分布于水库、池塘和溪流,牛蛙的生境与6种当地蛙有部分重叠;(3)养殖时管理不善造成的牛蛙逃逸,以及牛蛙价格过低而导致养殖户将牛蛙弃置野外可能是牛蛙入侵的主要原因。牛蛙对当地蛙的潜在威胁很大,开展牛蛙的分布、食性和种群动态研究是当务之急。     

牛蛙主要消化酶的分布及pH和温度对消化酶活力的影响

研究了牛蛙消化系统蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的分布情况以及pH和温度对这些消化酶活力的影响.结果表明:在各自生理pH值下,牛蛙消化系统不同部位蛋白酶活力大小顺序依次为胰脏>胃>中肠>食道>前肠>后肠,胃、肠和胰脏蛋白酶的最适pH值分别为2.2、7.4和9.6,最适温度分别为45℃、50℃和45℃.脂肪酶活力大小顺序依次为胰脏>后肠>中肠>前肠>胃>食道,胃、肠和胰脏脂肪酶的最适pH值分别为2.2、7.4和8.0,最适温度均为50℃.淀粉酶活力大小顺序依次为胰脏>中肠>后肠>前肠>胃>食道,胃、肠道和胰脏淀粉酶的最适pH分别为7.0、8.0和9.6,最适温度均为35℃.在牛蛙消化系统未检测到明显纤维素酶活力.     

Diet composition of post-metamorphic bullfrogs (Rana catesbeiana) in the Zhoushan archipelago, Zhejiang Province, China

Bullfrogs (Runa catesbeiana) are listed as one of the 100 worst invasive alien species in the world.They are generalist predators and thus may affect native species through predation.In previous studies,the food contents of bullfrogs were mostly examined at a single site.In the present study,the diet composition of post-metamorphic bullfrogs on eight islands (Daishan,Liuheng,Xiushan,Fodu,Taohua,Xiashi,Cezi,and Putuoshan) in the Zhoushan Archipelago,Zhejiang Province of China,were examined by using the stomach flushing method from June 30 to August 11 in 2005.A total 0f391 individual frogs were measured,including 113 adults and 278 juveniles.The analysis of the stomach contents shows that,for adult bullfrogs,the most important prey (by diet volume) overall were Decapoda,Coleoptera,Odonata,Mesogastropoda,Raniformes,and Cypriniformes.For juvenile bullfrogs,these were Decapoda,Coleoptera,Cypriniformes,Odonata,Orthoptera,Hymenoptera,Lepidoptera larvae,Mesogastropoda,and Raniformes.Moreover,the prey size and diet volume increased with the body size of both adult and juvenile bullfrogs.The diet composition of primary preys of bullfrogs was significantly different among the islands.The results indicate that bullfrogs exert different predatory influences on native fauna at different sites and that bullfrogs are generalist predators with extensive ecological impacts on native fauna.     

牛蛙神经冲动产生和传导的低温效应

在5℃和15℃温度条件下,用牛蛙(Rana catesbeiana)离体坐骨神经标本测定0、24、48、96、120、144、168、192、216 h 9个时段的动作电位波幅和传导速度.结果表明:两个温度下离体坐骨神经的动作电位幅度在0 h和24 h差异均不显著,0 h时相对高温(15℃)下动作电位传导速度大于相对低温(5℃),24 h时两个温度下动作电位的传导速度差异不显著,相对高温下48 h时坐骨神经的兴奋性为零.相对低温条件下,坐骨神经兴奋性能维持7 d时间.     

同一生境牛蛙与昭觉林蛙蝌蚪的食性比较

对采自昆明东北郊同一水塘的牛蛙和昭觉林蛙蝌蚪进行食性分析。结果表明 ,牛蛙蝌蚪Ⅰ、Ⅱ期的食物种类分别为 8大类 5 1种和 37种 ,而昭觉林蛙蝌蚪Ⅱ期的食物种类有 6大类 30种 ;两者的食物组成均以硅藻门、绿藻门、蓝藻门为主 ,但昭觉林蛙蝌蚪Ⅱ期与牛蛙蝌蚪Ⅰ期的摄食种类差异极显著 ,与牛蛙Ⅱ期的不显著。昭觉林蛙蝌蚪Ⅱ期与牛蛙蝌蚪Ⅰ、Ⅱ期的食物生态位重叠度分别为 0 6 95 2和 0 6 887,单位体重摄食的生物量分别是后两者的 10 96倍和 15 4 8倍 ,但百分率相似性指数并不高 (分别为 5 4 95 %和 5 8 11% )。与等重量牛蛙蝌蚪相比 ,昭觉林蛙蝌蚪食物量较大 ,即昭觉林蛙蝌蚪为生存所需要的生物量远高于牛蛙蝌蚪。本文结果及野外观察表明 ,昭觉林蛙与牛蛙蝌蚪存在较激烈的食物竞争 ,且前者处于不利地位。     

Functional morphology of feeding and gill irrigation in the anuran tadpole: electromyography and muscle function in larval Rana catesbeiana

This study provides the first data on muscle activity patterns during active feeding in a larval anuran. Data regarding muscle function during gill irrigation and hyperexpiration are also provided. Electromyographic and kinematic data were recorded from six mandibular and hyoid muscles in unanesthetized, unrestrained larvae of Rana catesbeiana. Only three (hyoangularis, orbitohyoideus, anterior interhyoideus) of the six muscles examined are active during gill irrigation. Feeding cycles are characterized by the recruitment of three additional muscles: intermandibularis, suspensorioangularis, and levator mandibulae longus superficialis. The latter two contribute, respectively, to wide opening and forceful closing of the mouth during feeding. Hyperexpiration is characterized by a reversal of water flow anteriorly out of the mouth. This hydrodynamic change occurs due to modulation of the timing of firing of the anterior interhyoideus, as well as recruitment of the posterior interhyoideus, which is only active during hyperexpiration. Both regions of the interhyoideus, which are responsible for evacuation of the buccal cavity, are active during the opening phase of hyperexpiration. Kinematically, transitioning from gill irrigation to feeding involves both an overall shortening of the gape cycle and a shift in the relative length of opening phase vs. closing phase. Our results corroborate many of the findings of Gradwell ([1972] Can J Zool 50:501-521) regarding muscle function during gill irrigation and hyperexpiration. Furthermore, we demonstrate that in larval anurans the transition from gill irrigation to feeding involves modulation of gape cycle kinematics, changes in the level of activity of muscles, and recruitment of muscles that are not active during irrigation. In light of new data presented here, a review of muscle function in tadpoles is also provided.     

性类固醇激素受体ER、AR和PR在牛蛙胃肠胰的定位

本文用免疫组织化学技术检测及光密度定量分析,研究4种性类固醇激素受体在牛蛙(Rana catesbeiana)胃肠胰内的定位及表达的强弱,探讨4种性类固醇激素在牛蛙胃肠胰中的功能。染色结果显示,4种性类固醇激素受体在牛蛙胃肠胰内都有分布,雌雄之间分布差异较小。雌激素受体α(ERα)主要分布在牛蛙胃腺、直肠固有层和胰腺中;雌激素受体β(ERβ)主要分布在食道上皮、直肠固有层和胰腺中;雄激素受体(AR)主要分布在食道上皮、直肠固有层和胰腺中;孕激素受体(PR)主要分布在空肠、食道上皮和胰腺中。光密度检测结果显示,雌激素受体α(ERα)在牛蛙胃和直肠中阳性反应最强,在胰腺中相对较弱。雌激素受体β(ERβ)在牛蛙直肠中阳性反应最强,胰腺和食道次之。雄激素受体(AR)在食道中阳性反应相对较强,其他部位都较弱。孕激素受体(PR)在空肠中的阳性反应较强,其他部位都较弱。雌激素受体α(ERα)在胃中以及雄激素受体(AR)在食道和直肠中的免疫阳性反应均是雌性牛蛙强于雄性牛蛙,雌激素受体β(ERβ)在胰腺中的免疫阳性反应是雄性牛蛙强于雌性牛蛙。4种性类固醇激素受体中,雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)在牛蛙胃肠胰中的分布最多,雄激素受体(AR)、孕激素受体(PR)的分布相对较少。性类固醇激素受体主要分布在食道、胃、直肠和胰腺中,其中,分布最多的部位是胃和直肠。4种性类固醇激素受体在牛蛙胃肠胰内的分布表明,性类固醇激素对牛蛙消化功能特别是胃和直肠的功能具有多方面的调节作用。