文摘

010 0 93人可溶性肿瘤坏死因子受体Ｉ型基因在黑曲霉中的表达[中 ]/李敏… / /科学通报 .- 2 0 0 1,4 6( 1) .- 5 7～ 60将人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型 (ｓＴＮＦＲＩ)基因插入黑曲霉 (Ａ .ｎｉｇｅｒ)融合蛋白基因的表达质粒 ｐＩＧＦ中 ,融合之处设计类胰蛋白酶 (ＫＥＸ2 )加工位点 ,构建融合表达载体ｐＨＢＣ。以 ｐＨＢＣ转化黑曲霉胞外蛋白酶缺失株Ａ .ｎｉｇｅｒ3 .795 - 1- 2 3 ,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性克隆Ａ .ｎｉｇｅｒ3 .795 - 1- 2 3重组菌株的蛋白电泳显示有特异表达带 ,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ证实该分泌…     

小肽多拷贝基因表达载体的构建及其高效表达(英文)

介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相对称粘性末端 ,一次连接反应就构建出一系列不同基因拷贝数的表达载体 ;在小肽基因两端分别引进编码FactorXa和羟胺蛋白切割位点的序列 ,表达出的融合蛋白可被FactorXa和羟胺剪切出不残留任何外源氨基酸的小肽 .不同拷贝数的小肽融合蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中均获得高效表达 .     

人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

本文利用PCR技术,对人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因进行了改造,并将其与人白细胞介素-6(hIL-6)成熟肽编码区cDNA进行融合,构建了5′IL-6-TNF△融合蛋白的表达质粒pBVIL6-TNFA△。DNA序列分析证明,PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计序列及相应的cDNA序列完全一致;重组子用限制性内切酶酶切鉴定,含有正确的IL6-TNF△融合cDNA片段;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量约为37kD,与预计的相符合;生物学活性分析初步表明,该融合蛋白具有抗肿瘤活性。     

人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定

为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HAS)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HAS-AX15 (R13K)。HAS-AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HAS融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg/kg的HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg/kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HAS-AX15(R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。     

肿瘤坏死因子α和β对电离辐射诱导细胞凋亡的效应

为探讨肿瘤坏死因子(tumor necrosis foctor)α和β(TNFα和β)对电离辐射诱发细胞凋亡的效应及其机理,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和FACS分析等方法,观察了人肿瘤坏死因子α(hTNFα)和β(hTNFβ)对~(60)Co-γ射线诱发细胞凋亡的形态学,生化学变化。结果显示:hTNFα或hTNFβ均可明显抑制~(60)Co-γ射线诱发正常人胚肺二倍体细胞(2BS)的凋亡,而相同剂量的hTNFα能促进~(60)Co-γ射线诱发的人体肺腺癌细胞系A549细胞凋亡,而对另一株人体肺癌SPC细胞的效应比A549降低1倍;hTNFβ能分别增强A549和SPC的细胞凋亡频率。由此认为,hTNFα和hTNFβ均可通过调节细胞的生理生化反应来改变细胞对电离辐射的敏感性,可保护正常细胞免受辐射损伤,而增加某些肿瘤细胞对辐射的敏感性。     

人肿瘤坏死因子与人γ干扰素重组双功能融合蛋白的研制

肿瘤坏死因子与γ干扰素具有非常相似的生物学活性,并在一些主要的生物活性方面表现有较强的协同作用。本文采用寡核苷酸指导下的定位缺失-插入体外基因突变技术,删除了干扰素与肿瘤坏死因子串联基因之间的非编码区,去徐了γ干扰素的翻译终止信号,插入了一个人工设计的连接肽,使γ干扰素与肿瘤坏死因子基因在不改变读码框架的条件下融合起来,并在大肠杆菌表达系统中表述了兼有γ干扰素和肿瘤坏死因子功能的融合蛋白。     

NifA蛋白的N末端结构域决定肺炎克氏杆菌和阴沟肠杆菌中NifA蛋白的温度敏感性

NifA蛋白是固氮基因的中心调节物.它激活nif基因转录时依赖于σ54-RNA聚合酶全酶.肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)NifA蛋白由3个结构域组成,即功能不明的N末端结构域,具有ATP酶活性的中心催化结构域和C末端DNA结合结构域.Kp NifA蛋白对温度敏感,而阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,Ec)NifA蛋白的温度敏感性不如Kp NifA蛋白.实验结果表明NifA蛋白的N末端结构域对该蛋白的温度敏感性起决定性作用.     

重组胸腺素α1的纯化及活性

将胸腺素α1基因4串体克隆于pThioHisA融合表达载体(pThioHisA-Tα1④),转化大肠杆菌TOP10。在IPTG诱导下,融合蛋白得到了高效表达。SDS-PAGE分析确定诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的40%,且表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。把用离子交换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解,经简单的离子交换层析可纯化出胸腺素α1单体,HPLC鉴定胸腺素α1的纯度达98%。利用3H-TdR进行生物活性测定,证实融合蛋白和胸腺素α1单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下,刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的胸腺素α1相比具有相似的生物活性。     

植物遗传工程

950657 碗营井素对大夏种子贮藏蛋白基因在转基因矮牵牛中表达的影响[英]/Fujiwara,T.…,PlantPhysi01.一1992,99(1).一263～268["译自DBA,1992,11(14),92—08042] 构建了转基因矮牵牛(Petumia hybrida)。它携带大豆7 S种子贮藏蛋白(声一conglycinin)的口k或夕一亚基基因,目的是检测矮牵牛中是否存在不同的基因表达方式。将质粒pBINl9-口,和pB-INl9一声导入根癌土壤杆菌C58C1 RifR(质粒p—G V2260)中。用得到的菌株侵染矮牵牛cv.VR杂种的叶圆盘,并于8月内再生转基因植株,将转基因植株未成熟种荚外植体培养在含或不含甲硫氨酸的固…     

人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达

利用基因工程表达的方法,在大肠杆菌中通过与GST蛋白融合的方式高效表达了胸腺素α1前体基因,随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式,得到了胸腺素前体肽段31肽和N端未经乙酰化修饰的28肽。融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的35%～40%,样品肽的产量也达到了约200mg/L（肽/发酵液）的产量。经质谱测定,分子量分别为3366和3066。BalB/C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明,所构建的GSTTα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用,其中N端未经乙酰化的28肽产物与31肽产物活性相近,均对淋巴细胞具有明显的刺激增殖作用。     

EGFP/SDCT1融合蛋白表达、亚细胞定位信号分析、组织分布及电生理功能研究

从正常人肾中克隆低亲和力钠离子依赖二羧酸共转运蛋白 1(sodium-dependent dicarboxylate co-transporter 1, SDCT1, NADC1)全长基因, 并将其和N端及C端缺失突变的SDCT1基因分别插入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达载体中构建EGFP/SDCT1融合蛋白真核表达载体, 然后将它们转染到人肾小管上皮细胞HKC中表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位情况以确定其定位信号. 双重PCR分析证实融合基因已整合到细胞基因组中, Western blot显示融合基因已在细胞中得到表达. 共聚焦显微镜分析显示正常人SDCT1蛋白主要定位于细胞膜上, 与生物信息学的预测结果一致, 而C端缺失的SDCT1基因转染的细胞, 其绿色荧光位于细胞质, N端缺失基因转染的细胞, 其绿色荧光主要位于细胞膜上. 将体外转录的融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达并用双电极电压钳技术记录细胞跨膜电流, 结果在卵细胞膜上测定出了Na⁺内向电流. 免疫组化结果显示SDCT1主要表达于人近端肾小管上皮细胞的管腔侧, 而在远端肾小管、集合管、肾间质和肾小球中未见SDCT1的表达. 上述研究表明, 正常人SDCT1蛋白定位于近端肾小管上皮细胞的管腔侧膜上, SDCT1蛋白的C端部分对于其合成后的迁移及靶向定位是必需的, 人SDCT1蛋白的细胞膜定位序列可能位于其C端部分.     

易于基因产物加工和快速纯化的融合表达载体

从Protein A基因酶切分离出编码完整的结合IgG的B、C区域(PABC)的相应DNA片段,克隆进噬菌体M1乳通过人工合成寡聚核苷酸引物,突变修饰B、C区域内分别含有的羟胺裂解位点,变As-Gly为Asn—A1a。利用突变修饰后的PBACm编码基因片段,构建了一组含有不同阅读框架的融合蛋白表达载体。进一步分别重组克隆了含人工合成的人胰岛索样生长因子Ⅰ(IGF—Ⅰ)、人和牛生长激素释放因子(GRF)等基因的表达质粒,在大肠杆菌中高效表达出PABC—IGF—l、PABC—hGRF、PABC-bGRF及其衍生型融合蛋白。经SDS—PAGE测定分析,每立升摇瓶的融合蛋白产量可达100mg以上。上述高效表达的PABC融合蛋白,通过固相亲和层析柱一步分离．获得SDS—PAGE鉴定为近均一分子量纯化的PABC融合表达产物。     

肿瘤坏死因子α和β对电离辐射诱导细胞凋亡的效应

为探讨肿瘤坏死因子（tumor necrosis foctor)α和β（TNFα和β）对电离辐射诱发细胞凋亡的效应及其机理,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和FACS分析等方法,观察了人肿瘤坏死因子α（hTNFα)和β（hTNFβ)对^60Co-γ射线诱发细胞凋亡的形态学,生化学变化。结果显示：hTNFα或hTNFβ均可明显抑制^60Co-γ射线诱发正常人胚肺二倍体细胞（2BS）的凋亡,而相同剂量的hTNFα能促进^60Co-γ射线诱发的人体肺腺癌细胞系A549细胞凋亡,而对另一株人体肺癌SPC细胞的效应比A549降低1倍;hTNFβ能分别增强A549和SPC的细胞凋亡频率。由此认为,hTNFα和hTNFβ均可通过调节细胞的生理生化反应来改变细胞对电离辐射的敏感性,可保护正常细胞免受辐射损伤,而增加某些肿瘤细胞对辐射的敏感性。     

植物中的Dof 蛋白和Dof转录因子家族

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物所特有的一类转录因子.其N末端保守的单锌指Dof结构域是既与DNA又和蛋白相互作用的双重功能域,识别的核心序列是AAAG;其C末端氨基酸序列较为多变,是Dof蛋白的特异转录调控结构域.Dof类转录因子在植物中发挥着多种功能.拟南芥和水稻的Dof转录因子家族为Aa、Bb、Cc、Dd 4个同源基因群,同类群间可能具有相似或相反的功能.文章就这一问题的研究进展作了介绍.     

医药其它

931310资白工程:作为血液代用品的改良血红蛋白〔英〕/Jessen,T.H.…1 Angew.Chem.Int.Ed。Engl一2902,31(7)。一545~549[译自DBA,1992,11(21),92一11833〕 在大肠杆菌、酿酒酵母及转基因的小鼠和猪中完成了全功能人血红蛋白的表达。这些重组的血红蛋白在未修饰的情况下不能作为血液代用品,因为在缺乏2,8一二确酸甘油酸时该蛋白具太高的氧亲和性,并分裂为二聚体。上述向题已通过蛋白工程解决了。通过甘氨酸残基将2个a链中的1个的C一末端与另一个相连接,这个C一末端的3一维结构与其它a蛋白链的N一末端相近。该融合子不能使血红蛋白的亲…     

抗 HER2-hTNF-α新型免疫毒素的制备及功能研究

HER2/neu 基因在肿瘤中的过度表达使其成为许多肿瘤的标志分子 . 为了增加过度表达 HER2/neu 的肿瘤细胞对肿瘤坏死因子 (TNF) 的敏感性和提高 HER2/neu 抗体的肿瘤杀伤效应,将抗 HER2/neu 单链抗体 C6.5 与人肿瘤坏死因子 hTNF-α融合,构建了 scFvC6.5-hTNF-α融合蛋白,完成了重组蛋白在大肠杆菌中的表达,产率为 400 μg/L 菌液 . 经过亲和层析和柱复性,融合蛋白的纯度达 95％以上 . ELISA 试验表明, scFvC6.5-hTNF-α能够特异结合 HER2/neu 阳性卵巢癌细胞 SKOV-3 和乳腺癌细胞 MCF-7 ,而不结合 HER2/neu 阴性的黑色素瘤细胞 A375. MTT 试验表明, scFvC6.5-hTNF-α能够选择性地杀伤 SKOV-3 和 MCF-7 细胞,而不影响 A375 细胞的生长 . 这种肿瘤细胞特异性杀伤作用提示该免疫毒素具有肿瘤靶向治疗的潜在应用价值 .     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

应用核酸适配子检测细胞因子的新方法—ELONA法

以人肿瘤坏死因子(Human tumor necrosis factor,hTNF—α)特异性的核酸适配子为检测分子建立了酶联寡聚核苷酸吸附试验(Enzyme—linked Oligonucleotide assay,ELONA)方法,用于hTNF—α的检测。通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)方法从随机RNA库中筛选到与hTNF—α特异结合的RNA适配子。根据其序列,用体外转录方法合成生物素标记的RNA适配子,并对其进行了氨基修饰以增加其稳定性。以hTNF—α的单克隆抗体为捕获分子,生物素标记的hTNF—α特异性RNA适配子为检测分子建立了ELONA方法,并对这种检测方法的灵敏度、精密度和准确度等进行了分析。同时用ELONA和ELISA方法检测了正常人血清中的hTNF—α水平,并对检测结果进行比较。结果显示,ELONA方法的灵敏度为100pg／mL,具有较好的精密度和准确度。ELONA法的检测结果与ELISA法检测结果基本一致。该方法适用于血清、细胞培养上清等多种生物标本中各种细胞因子及其它蛋白的检测。     

激素和活性多肽

89飞石02人降钙素基因的化学合成与表达[英〕八、:、1飞。、,,工,…、2 Ce,le一xs87,59 (昌一3)一223一23。巨译自DB八,1988, 7(18),88一08890] 降钙素(C‘即被川一卜治疗严吸的高钙血症或骨吸收的疾病。而长期使川动物CT会导致反应性降低。合成的人CT基因 口ICT)含有双股DN入,各有106个核昔酸。构建J’贡组质粒p,!尸1尺。一hCT,井用之转化大肠杆菌K一12(LE392)。细菌产泣址的hCT在N末端多一个甲硫氨酸残基,{盯C末端无酷胺化作用。贡纵大肠杆菌细胞直接在止入/1酉普酸,}J破碎,真空冷冻干燥酸性j二清液收取hC尸f丫l衫大鼠禁食后,”…     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。