几丁质酶表达质粒pKChiA和pMChiA的构建及表达*

从质粒pLCHIA中切出含粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens)几丁质酶基因 (chiA)的 1 8kbHinfI片段 ,将其插入到表达载体pKK223-3强启动子Ptac下游的SmaI位点内 ,构建成几丁质酶表达质粒pKChiA。再用内切酶BamHI从pKChiA质粒中切出 2.1kbPtac ChiA片段 ,并将其重组到质粒pMC71A的单一BamHI位点内 ,构建成另一种几丁质酶表达质粒pMChiA。这两种质粒可在大肠杆菌HB101和JM10     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/HindⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后回收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3.3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100%,解离后的质粒稳定性为93%。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

恶性疟原虫CTL抗原微表位基因重组疫苗的构建和免疫原性预测

选用中国人群常见的MHCⅠ类分子HLA-A2.1和HLA-B51限制性恶性疟CTL抗原表位, 构建了单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh,再将上述表位DNA序列串联,构建成双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts.将3种重组疫苗分别转染C1R/HLA-A2.1和K562/HLA-B51细胞后均证实表达.单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh的表达分别促进细胞表面HLA-A2.1和HLA-B51的稳定性.免疫共沉淀实验证实上述表位促进细胞表面HLAⅠ类分子组装,并提示特异性表位在细胞表面的递呈.双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts在以上两个不同细胞系中的表达与两个单表位微型基因的表达结果相似,证明双表位肽的串联编码构型不影响肽链中不同表位的特异性抗原递呈.这一研究结果为进一步设计具有广泛覆盖率的多表位恶性疟重组CTL疫苗提供了理论和实验基础.与常规体外CTL实验不同,本研究观察微表位基因在表达特定MHCⅠ类分子的人细胞中进行内源性抗原递呈的过程,其方法更接近人体内环境,对于人类CTL抗原表位的确定和人重组CTL表位疫苗免疫原性的预测具有重要意义.     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS-PAGE蛋白电泳表明在39.9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以 Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该399kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36.9 kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为疫苗的候选成份提供理论基础。     

质粒pRSET-A前导肽串联多聚体的构建及其多克隆抗体制备*

质粒pRSET-A是一个常用的高效原核表达载体,编码一N端含组氨酸标签（6×His）的34aa前导肽序列,以方便利用抗组氨酸标签抗体鉴定或纯化所表达的重组蛋白。本实验设计一对两侧含编码疏水性氨基酸密码子的引物,经过扩增前导序列10~34aa基因序列,并重新克隆入质粒pRSET-A构建串联二聚体后,再利用质粒pRSET-A的BamH I / Bgl II同尾酶克隆位点,经一系列简单的酶切和连接,快速构建这一前导肽中不含组氨酸标签序列的串联多聚体基因,并成功表达其六聚体重组蛋白。将此重组蛋白主动免疫山羊,获得了能够特异地识别pRSET-A编码的N端前导肽序列的抗体。结果显示,所制备的羊抗10~34aa前导肽抗体能够识别pRSET-A指导表达的含有完整前导肽的重组蛋白,但不能识别不含10~34aa序列的重组蛋白;同时,利用同位酶技术可以快速高效构建短肽的串联多聚体以制备具有高免疫原性的亚单位疫苗或免疫调控物质。     

蜂毒溶血肽前体蛋白cDNA的克隆及其融合蛋白的表达

从蜜蜂毒腺中提取总RNA ,通过RT PCR扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的cDNA ,将扩增产物克隆到 pT7Blu T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到 pUC1 1 8载体上 ,构建了重组质粒pUMP。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的cDNA序列与所发表序列完全相同 ,且与 β 半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框。含重组质粒 pUMP的大肠杆菌DH5α表达了与β 半乳糖苷酶部分序列融合的蜂毒溶血肽前体蛋白     

SARS病毒S和N蛋白抗原表位的基因合成、融合表达及纯化鉴定

通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列 ,初步确定含强抗原表位的N蛋白片段和S蛋白片段 ,共 5 6 0个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子 ,化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列 ,利用基因工程技术将两个基因片段串联 ,克隆至质粒Pet2 8a(+)内的NcoⅠ/EcoRⅠ位点 ,表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) ,筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌 ,表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,部分以可溶性形式存在。经离子交换柱和反相高压液相纯化获得了表达的融合蛋白 ,经初步鉴定 ,显示该融合蛋白有较好的抗原性和特异性.     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

酵母RNA聚合酶ⅡRpb2和Rpb3两亚基间相互作用位点的定位

为研究S .pombeRNApolⅡ各亚基间体内装配成复合体的机制 ,本文首次用酵母双杂交系统鉴定了Rpb2和Rpb3两亚基间体内相互作用的位点。首先将Rpb2的 4个片段克隆至Gal4BD表达载体pAS2上 ,构建BD Rpb2片段融合蛋白重组质粒 ;同时将Rpb3克隆至Gal4AD表达载体pGADGH上 ,构建AD Rpb3融合蛋白重组质粒。其次 ,将pGADGHRpb3分别与pAS2Rpb2各片段重组质粒共转化到受体酵母菌Y1 90感受态细胞内 ,筛选并鉴定β gal活性阳性 (β gal+)的共转化子。最后 ,将β gal+共转化子中的Rpb2片段进行序列分析并进行同源序列比较确定其在Rpb2中的位置。结果表明 ,Rpb2与Rpb3相互作用的位点位于Rpb2的 90 2～ 989aa肽段内     

人绒毛膜促性腺激素β亚基单一B-细胞表位(β5、β9或β8)融合蛋白的表达和纯化

作为开发新型实用性人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗的一种尝试, 我们已构建若干组合靶抗原三个线性B- 细胞表位和外源强T- 细胞表位的基因工程hCG嵌合肽。为了检测用这些嵌合肽免疫的动物血清中是否能产生抗各表位的三种抗体,本研究选用能在大肠杆菌中高表达和与生物素亲和性强且特异(方便通过亲和层析纯化)的链霉亲和素为载体,分别构建了三种含β-hCG不同单一线性B_细胞表位(β5,β9和β8)的融合蛋白。在链霉亲和素基因下游多克隆区EcoRⅠ和Hind Ⅲ位点插入各表位编码基因片段(带TAA终止密码子)的pTSA-18重组质粒, 转化BL21(DE3)pLysS宿主菌后, 它们在IPTG诱导下均能以较高水平表达各自目的融合蛋白,而且它们的表达产物在Western blot鉴定中都能被抗各表位特异的多抗或单抗或抗报告表位单抗识别。用改良的制备性PAGE方法可以一步纯化电泳均一性高于95%的三个融合蛋白, 它们的收得率相对1L培养物约为5 mg。作为化学合成表位肽的替代物, β-hCG三个单一B- 细胞表位融合蛋白的可获得性将有助于所构建hCG基因工程嵌合肽以及其他hCG疫苗,也包括它的DNA疫苗的免疫原性分析。     

谷氨酸棒杆菌质粒pXZ10145自发缺失突变体的特性及其重组质粒的构建

用谷氨酸棒杆菌质粒pxz10145转化钝齿棒杆菌T 6—13原生质体,得到自发缺失突变体pNAT65,该质粒为2．4kb,仍带有氯霉素抗性,经物理图谱分析表明,质粒pxz10145smaⅠ到claⅠ位点之间的片段已缺失,仍保留EcoRⅠ、XbaⅠ、BclⅠ三个酶的单切点。质粒pNAT65与pBR322用EcoRⅠ酶切连接得到重组质粒pNAR67,这一质粒在E．Coli中复制并表现Ap, Tc抗性,但氯霉素抗性能力大大降低,只能抗2μg／ml。     

小鼠红细胞分化-去核因子的发育期相关性表达与鉴定

以质粒pBS-SK-MEDDF上的小鼠 MEDDF cDNA片段为模板,通过PCR方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到pGEM-T-Easy质粒中,经DNA序列测定后,证明其克隆序列正确,再将MEDDF编码序列定向克隆到表达载体pET-30α(+)的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建了原核表达载体,在获高效表达菌株中,特异表达蛋白质的量占细菌总蛋白的40%.以纯化的该蛋白质为抗原,免疫新西兰纯种大耳兔,获得高效价的抗血清.经免疫细胞化学验证,MEDDF在红细胞的表达具有发育阶段特异性,推测与小鼠红细胞终末分化的启动及细胞核浓缩相关.另外,MEDDF还在小鼠骨髓中的粒细胞系及巨核细胞系表达,说明该蛋白质与小鼠骨髓髓系细胞的分化有渊源关系.     

苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关的DNA片段的克隆

以耐盐的苜蓿中华根瘤菌(\%Sinorhizobium meliloti) \%042B为材料,制备其总DNA,经过限制性内切酶\%Eco\%RⅠ的部分酶解,利用电洗脱方法回收15～25kb大小的DNA片段。以碱法制备载体质粒pLAFRⅠ,用\%Eco\%RⅠ将其切成线状,然后用T\-4DNA连接酶将回收片段与线状载体连接,利用包装蛋白进行包装后,感染大肠杆菌(Escherichia coli)S17\|1,构建了042B的基因文库。以固体亚硝基胍作为诱变剂处理出发菌株,在05mol/LNaCl的条件下,从2000个菌落中筛选得到12株042B的盐敏感突变株,以其中稳定的盐敏突变株GZ17为受体菌,利用两亲本杂交将含有042B的DNA片段的pLAFRⅠ重组质粒转移到GZ17中,在含有四环素和05mol/LNaCl的基本培养基上筛选出能够耐盐的阳性克隆,获得了与耐盐有关的7kb长的DNA片段。对该片段进行亚克隆,最终获得了4kb与耐盐有关的片段。     

同尾酶技术在构建疟疾多价重组DNA疫苗中的应用

同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但能酶切产生相同粘性末端的限制性内切酶,依靠同尾酶的这种特性,可以根据需要将不同的ＤＮＡ 片段进行灵活组合,获得各种排列顺序的多价表位重组疫苗．将这种方法用于疟疾多价重组ＤＮＡ 疫苗的研制;ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠免疫实验对所得重组疫苗ＰＵ２８６的免疫原性进行了测定．     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)C-2总DNA经PstI部分酶切后分离2～10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长3.0kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulans C-2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。     

口蹄疫病毒多基因重组质粒在BHK-21细胞中的表达

利用定点突变的原理,获得包含有口蹄疫病毒P1,2A,3C及部分2B编码区的目的基因片段,KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1（+）,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,将重组质粒pcDNA3.1/P12X3C转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法,检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒基因片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。     

含par位点的重组质粒Psjm3的构建及其稳定性研究

利用自然质粒pSC101par位点的分离稳定性功能,构建了含par位点的质粒pSJM4和pSJM3,通过在同样宿主E.coli HB101中的稳定性比较研究表明,不含par位点的重组质粒pSJ3很不稳定,E.coli G3(pSJ3)在培养到第10代时已开始出现pSJ3的丢失,到培养至50代时则已全部丢失;而含par位点的重组质粒pSJM3则表现得十分稳定,E.coli G3-1(pSJM3)经70代培养,仍无明显的质粒丢失现象,其稳定率保持97%以上。通过对不含par和含par的非重组质粒pUC18和pSJM4的稳定性比较也获得同样的结果。通过对E.coliG3(pSJ3)和E.coli G3-1(pSJM3)的产酶活性比较研究表明,G3-1菌株明显高于G3菌株,说明我们构建的重组质粒pSJM3上的par位点功能不仅没有因外源基因的表达而受影响,而且有利于外源基因的表达。     

专一切割苹果锈果类病毒多体自切割核酶的克隆和转录物的体外活性测定

将苹果锈果类病毒的1个14nt的靶序列连接在锤头型核酶的3′末端,构成自切割核酶。经人工合成和PCR扩增,克隆在转录载体pGEM7zf（＋）的XhoⅠ-Hind Ⅲ位点。利用限制酶Xho I与SalI的连接,消失其识别位点序列,将自切割核酶片段插入到重组质粒中,经连续5次亚克隆,分别获得2、4、6、8、10和12拷贝的多体自切割核酶。在T7RNA聚合酶作用下,线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子,提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和12体自切割核酶分别对32P标记的靶ASSVd进行反式切割,核酶与靶RNA摩尔浓度比为1：1。放射自显影结果表明：多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶。我们推测多体自切割核酶在体内系统中可能具有更好的应用价值。     

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达

以棉铃虫颗粒体病毒(Helicoverpa armigera granulosis virus,简称HaGV)基因组DNA为模板,设计引物PCR扩增病毒增效蛋白(Enhancin)基因,然后经SacI/PstI双酶切消化,得到5′端截短的约2.1kb增效蛋白基因片段,再与pQE30质粒连接,构建了重组表达载体pQE/EnC,转化大肠杆菌M15(pREP4),在IPTG诱导下表达出分子量约为78×10³ D的融合蛋白并命名为P78,纯化的P78包涵体显示了明显的增效活性,可提高AcMNPV对小菜蛾幼虫的感染率27.88%～32.92%。     

用基于“Neo/E”的技术构建重组质粒

根据重组工程原理,建立了一种用于构建重组质粒的 “neo/E”（抗生素/单酶切位点）选择与反选择新方法。首先采用 PCR方法扩增出线性打靶分子：然后进行两步体内同源重组,（1）neo/E基因敲入,重组子呈现neo抗性表型;（2）目的基因替换neo/E基因。用限制酶E消化时,发生第二步重组的DNA分子不能被消化,能够转化大肠杆菌受体菌DH5α。应用该方法构建了重组质粒pGL3-Basic PC1900T。PCR及测序鉴定证明：外源片段重组率为20%,所建立的重组工程选择与反选择新技术为质粒构建提供了新的解决方案。