基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子–偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。基于荧光蛋白的FRET技术已被广泛用于研究细胞信号通路中蛋白质–蛋白质活体相互作用检测、蛋白质构象变化监测以及生物探针的研制中。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针使得人们可以在时间和空间层面上研究细胞信号的转导过程。该文简要介绍了四大类基于荧光蛋白的FRET生物探针的设计、研制以及其在生物信号分子检测、活细胞成像以及药物筛选中的应用和进展情况。     

激光扫描共聚焦显微镜荧光探针的选择和应用

激光扫描共聚焦显微镜是检测生物荧光信号的最新技术手段。不仅广泛用于荧光定性、定量测量,还可用于活细胞动态荧光监测、组织细胞断层扫描、三维图象重建、共聚焦图象分析、荧光光漂白恢复、激光显微切割手术等。本文拟就激光扫描共聚焦显微镜常用的检测内容及其相关荧光探针的选择和应用做一简单的介绍。     

功能核酸荧光免标记型定量统一化检测技术的研究进展

功能核酸是一类具有特定空间构象、执行特异生物功能的天然或者人工核酸序列,具有易于修饰、价格低廉、稳定性高、特异性强等优势,其搭载免标记荧光传感系统后,功能核酸可起到将多种靶物质统一转为较为稳定的核酸信号,以及通过核酸扩增对检测信号进行扩增等重要作用。而免标记荧光传感技术可以在检测中免去荧光标记时荧光、猝灭基团的筛选和标记过程的繁琐和成本,同时可保证与核酸的特异或非特异性结合后产生荧光信号变化。通过两种技术的优势结合,检测的灵敏度、实时性可进一步提高,逐渐被广泛应用于环境污染物检测、食品风险因子检测、疾病诊断等多个领域。首先明确功能核酸与荧光定量检测技术等相关概念,详细阐述了几种重要的荧光物质的特点以及其与功能核酸的分子识别、作用方式与发光机制,接着紧紧围绕该种传感技术的几个特点,从功能核酸荧光免标记型定量统一化检测技术与其实际应用角度进行分类介绍与评价对比,最后就功能核酸荧光免标记型定量统一化检测技术在多种领域的检测分析中的研究意义以及存在的问题进行讨论,并对未来的发展与应用作出展望。     

Annexin V-FITC/DAPI细胞凋亡检测法

[目的]建立新的荧光染料DAPI与FITC标记Annexin V联合的细胞凋亡流式细胞术检测方法,以用于具有橙红色荧光的药物处理细胞的流式细胞术凋亡检测。[方法]以倒置荧光显微镜成像和流式细胞仪分别检测不同浓度DAPI对活和死细胞的标记作用。以荧光酶标仪检测不同浓度DAPI处理细胞的荧光信号,并进行相关性分析。以流式细胞术比较Annexin V-FITC/DAPI双染法与Annexin V-FITC/PI双染法对无色和含红/橙色荧光药物导致的细胞凋亡。[结果]DAPI标记可用于区分死细胞和活细胞,DAPI标记死细胞的荧光信号和DAPI的浓度呈线性正相关。Annexin V-FITC/DAPI双染法与Annexin V-FITC/PI双染法相比,二者对不含红橙色荧光药物诱导的多种肿瘤细胞的凋亡检测结果无显著差异。与Annexin V-FITC/PI双染法相比,Annexin V-FITC/DAPI双染法可有效避免药物自身荧光与PI通道重合导致的流式检测干扰。[结论]成功建立了新的Annexin V-FITC/DAPI双染法用于细胞凋亡的流式细胞术检测,该方法能够避免具有红、橙色荧光基团的药物对的干扰检测凋亡。     

基于VN210/VC210的双分子荧光互补定量分析cofilin-actin相互作用的特异性

摘要 目的：利用双分子荧光互补技术定量分析cofilin-actin的特异性相互作用。方法：首先构建表达VN210（编码荧光蛋白Venus 1-210氨基酸）和VC210（编码荧光蛋白Venus 210-238氨基酸）探针的质粒,通过梯度剂量转染检测该探针对的自组装能力;其次构建VN210/VC210与bJun、bFos、Fos△zip、cofilin（WT）、cofilin （S3E）和actin的融合表达载体,在HeLa细胞中分别过表达不同载体组合,以VN210-bJun/bFos-VC210组作为阳性对照,以VN210-bJun/bFos△zip-VC210组作为阴性对照,使用多功能细胞观测显微镜观察并拍摄荧光图像;最后使用多功能微孔板检测仪,对对照组进行波谱扫描,确定最适合检测的激发光波长和发射光波长,再以此选择波长检测实验组中可观察到荧光信号组合的荧光强度,进行统计分析。结果：(1) VN210/VC210在各转染剂量组中均未观察到荧光信号;(2) 阳性对照组可观察到荧光信号,阴性对照组未观察到荧光信号;实验组中,VN210-cofilin(WT)/actin-VC210组荧光信号较强,VN210-cofilin(S3E)/actin-VC210和VN210/actin-VC210组荧光信号较弱,其余组均观察不到荧光信号;(3) 产生荧光信号的实验组中,VN210-cofilin(S3E)/actin-VC210和VN210/actin-VC210组间的荧光信号无显著差异,但分别与VN210-cofilin(WT)/actin-VC210组具有显著差异。结论：VN210/VC210双分子荧光互补技术可定量检测cofilin-actin的特异性相互作用。     

鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

研究建立了鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。依据鳕鱼的16S rRNA基因序列设计一对PCR引物及探针,对12种鳕鱼样品和71种非鳕鱼动植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,只有12种鳕鱼样品产生荧光信号,其他非鳕鱼样品均不产生荧光信号,实验表明此方法具有特异性,其检测限为0.01 ng/μl鳕鱼DNA和0.01%鳕鱼肉粉。对市售的鳕鱼样品进行实际样品检测,均能很好地检出鳕鱼成分。此法特异性强,灵敏度高,可作为鳕鱼成分鉴定的检测方法。     

高灵敏荧光探针用于肿瘤 Ramos 细胞的快速检测

本文以聚苯乙烯纳米微球为载体,基于适体特异性识别和 DNA 杂交原理,组装了一种 DNA-CdTe 量子点纳米线,制备了具有较高荧光强度的复合型荧光探针,并成功用于 Ramos 细胞的荧光成像。该探针可以用于特异性识别肿瘤细胞,在荧光成像中信号强灵敏度高,为肿瘤细胞的检测提供一种新方法。     

用于雌二醇检测的免疫芯片技术

以卵清白蛋白为载体蛋白合成了雌二醇的结合物用Cy3新型荧光染料标记结合物 ,作为雌二醇的竞争物 ,建立了以竞争法为基础的检测食品中雌二醇的免疫芯片新方法。用生物芯片点样仪在醛基化玻片表面点样制备免疫微阵列 ,以扫描仪检测反应结果 ,对雌二醇进行了定性定量检测。实验结果表明荧光信号随待测物浓度的降低而增强 ,待测物浓度在 0.001～ 0.4μg/ml的范围内有较好的线性趋势 ,检测范围为 1～ 0.001μg/ml。     

高灵敏荧光探针用于肿瘤Ramos细胞的快速检测

本文以聚苯乙烯纳米微球为载体,基于适体特异性识别和DNA杂交原理,组装了一种DNA-CdTe量子点纳米线,制备了具有较高荧光强度的复合型荧光探针,并成功用于Ramos细胞的荧光成像。该探针可以用于特异性识别肿瘤细胞,在荧光成像中信号强灵敏度高,为肿瘤细胞的检测提供一种新方法。     

蓝色和黄色荧光蛋白在灵芝中的表达及黄色荧光蛋白在诱导型启动子Pcbh2活性分析中的应用

本研究中通过密码子优化和内含子添加分别构建了蓝色荧光蛋白基因(bfp)表达载体PJW-EXP-intron-opbfp和黄色荧光蛋白基因(yfp)表达载体PJW-EXP-intron-opyfp,使用灵芝Ganodermalingzhi原生质体进行转化,筛选得到了表达BFP和YFP的工程菌株。工程菌株的菌丝在荧光显微镜下可分别检测到蓝色和黄色荧光信号,而野生型菌株(WT)的菌丝检测不到这2种荧光,结果显示我们在灵芝中实现了蓝色和黄色荧光蛋白的表达。基于本研究建立的荧光蛋白表达方法,我们评估了纤维二糖水解酶Ⅱ基因的启动子(Pcbh2)在微晶纤维素诱导下的活性。将黄色荧光蛋白基因插入到Pcbh2启动子的下游构建yfp-Pcbh2表达载体,经过转化获得了YFP-Pcbh2灵芝工程菌株。在微晶纤维素的诱导下,检测到YFP-Pcbh2菌丝体可发出黄色荧光信号,而不加微晶纤维素诱导时则没有检测到荧光,结果表明Pcbh2启动子在微晶纤维素诱导下具有转录活性。