家蚕素Ⅱ基因原核表达及蛋白纯化

【目的】建立一种简便、 快速且能大量获得家蚕素Ⅱ （bombyxin-Ⅱ, BBXⅡ）的有效方法。【方法】运用RT PCR技术得到bombyxin-Ⅱ基因全长cDNA序列, 采用原核表达技术对该基因进行异源表达, 并利用亲和层析的方法得到纯化的BBXⅡ蛋白。【结果】从家蚕Bombyx mori头部mRNA中经过反转录获得bombyxin-Ⅱ基因的cDNA, 并构建了原核表达载体pET28a-BBXⅡ, 经过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导, 使BBXⅡ获得了大量表达, 进一步用HisTrap HP亲和层析, 成功得到大量纯化的BBXⅡ。【结论】本实验建立的原核表达方法和蛋白纯化技术, 是大量制备BBXⅡ的一种简易而有效的方法, 为进一步开展BBX的分泌机制和作用机理研究, 以及利用原核表达系统研发BBX降血糖药物奠定了基础。     

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体,并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建GAPDH/p ET-28a原核表达载体,获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白;经SDS-PAGE和抗His单抗检测,纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致;以该蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫,获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明,GAPDH抗体的效价为1:8000,并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体,为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶的原核表达与多克隆抗体制备

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶。该研究以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆苦荞DFR编码基因,并将其连接到表达载体pET47b上,转化获得苦荞DFR编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物,用亲和层析方法纯化蛋白,制备苦荞DFR多克隆抗体。RT-PCR技术获得了苦荞DFR编码基因的开放阅读框,重组表达载体经PCR和测序鉴定,表明表达载体构建成功,SDS-PAGE分析表达产物分别以可溶和不可溶的形式高效表达,亲和层析纯化得到融合蛋白,Western blotting显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的苦荞DFR蛋白在苦荞种子灌浆期中大量表达。苦荞DFR编码基因的原核表达与多克隆抗体的制备,为进一步开展DFR编码基因功能的研究奠定了基础。     

白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化

目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP53B原核表达及抗血清的制备

【目的】研究对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白sVP53B克隆、表达、纯化及抗血清制备。【方法】根据WSSV囊膜蛋白基因序列,设计引物,PCR扩增出功能序列(Svp53B),构建到pET-16b载体后,转化至大肠杆菌Rosetta 2诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting检测优化表达。表达产物采用Ni-NTA琼脂糖磁珠进行纯化、割胶回收融合蛋白,以纯化的Svp53B-his为抗原,免疫兔子获得多克隆抗体,通过间接ELISA检测抗体的效价。【结果】构建重组质粒pET-16b-Svp53B,在大肠杆菌Rosetta 2中以1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,主要以包涵体形式表达。纯化包涵体蛋白免疫兔子,获得多克隆血清,效价达到1:150 000。【结论】原核表达并纯化得到高纯度的WSSV囊膜蛋白sVP53B,制备的兔源多克隆血清亲和力高、特异性好,这对后期进一步研究VP53B与经口侵染相关功能奠定了基础。     

小鼠黑色素瘤相关抗原MART1的原核表达及抗体制备

目的:利用基因重组技术获得鼠黑色素瘤相关抗原MART1,并制备兔抗鼠多克隆抗体。方法:采用RT-PCR方法从小鼠黑素瘤B16-F1细胞株总RNA中扩增MART1的编码c DNA序列,并构建p ET32a-MART1原核表达质粒,将此质粒转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株后用IPTG诱导表达,获得的MART1融合蛋白依次用Ni-NTA亲和层析和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化,纯化的MART1融合蛋白用SDS-PAGE和Western印迹鉴定;以纯化的MART1融合蛋白为抗原,皮内接种日本大耳白兔,制备多克隆抗体,采用ELISA、Western印迹和细胞免疫荧光法分别检测兔血清中抗体的效价及抗原的特异性。结果:构建出MART1原核表达质粒,小鼠MART1基因在大肠杆菌Rosseta(DE3)中可诱导性表达并有效纯化;用纯化的MART1蛋白在日本大耳白兔中制备出高效价的多克隆抗体(效价1∶1 024 000),该抗体可与原核及真核表达的MART1蛋白特异性结合。结论:建立了鼠MART1蛋白原核表达和纯化技术,制备出的高效价和特异性抗MART1多克隆抗体将为黑色素瘤的防治研究提供技术支撑。     

spindlin1基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的:明确人新基因spindlin1的组织表达谱、相互作用蛋白。方法与结果:应用PCR技术获得spindlin1的开放读框,并将其插入原核表达载体pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,融合蛋白GST-Spindlin1获得了可溶性表达。用SDS-PAGE胶上的目的条带做抗原制备了多克隆抗体,进行了抗体纯化。结论:spindlin1在OVCar3细胞中可能以二聚体形式存在,这一现象还有待于进一步研究。     

人生长分化因子15的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化、鉴定人生长分化因子15(GDF-15),制备其多克隆抗体。方法:从人结肠癌细胞系HT29的cDNA扩增出GDF-15基因片段并插入pET-32a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组GDF-15,用镍亲和柱纯化,SDS-PAGE、Western印迹鉴定重组蛋白。用纯化的重组GDF-15免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,鉴定并检测其效价。结果:制备了pET-32a(+)-GDF-15表达载体;经IPTG诱导重组蛋白表达后,采用Ni亲和柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定;免疫BALB/c小鼠后获得了GDF-15多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶100000,并应用于肿瘤细胞的GDF-15检测中。结论:用基因工程和免疫学方法制备了重组人GDF-15及其多克隆抗体,为后续的分子机制和靶向治疗研究奠定了基础。     

重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。     

A型口蹄疫病毒VP0基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA.并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP0基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP0并亚克隆入pMD18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体pET32a用BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pET32-VP0.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP0并用SDS-PAGE进行检测.表达产物用镍亲和树脂进行了纯化.结果证明,口蹄疫病毒VP0蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料.     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。     

二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和We...     

日本三角涡虫热休克蛋白70(DjHSP70)C-端多肽表达及其抗血清制备

首先运用在线生物学软件对日本三角涡虫(Degusia japonica)热休克蛋白70(DjHSP70)氨基酸序列进行亲水区分析,发现该蛋白C-端含有较多亲水性氨基酸,然后以该段多肽序列为基础构建原核表达载体.采用PCR方法扩增450 bp cDNA片段,编码DjHSP70 C-端150个氨基酸多肽.将双酶切的cDNA...     

口蹄疫病毒非结构蛋白3abc基因的克隆与表达

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)非结构蛋白(NSP)—3ABC可用于注苗与感染动物的鉴别诊断,合成该基因的PCR引物,并在引物5’端和3'端分别加入含BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV毒株基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增3abc基因,得到的基因片段与T载体连接,转化DH5α。提取重组载体pT-3ABC,经BamHⅠ/HindⅢ双酶切后与载体pET32a连接,转化宿主菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达目的蛋白。SDS—PAGE及Western Blotting检测和鉴定结果表明,在大肠杆菌中成功表达了NSP—3ABC蛋白,分子量约56kDa,且该表达产物可与FMDV感染的动物血清产生免疫反应。ELISA试验结果显示,表达蛋白可用于FMDV注苗与感染动物的鉴别诊断。     

棉铃虫齿唇姬蜂嗅觉受体基因 CchlOrco 的克隆及组织表达谱分析

【目的】昆虫的嗅觉受体（olfactory receptors, ORs）一般以气味分子特异的ORs与共受体（ co-Receptor, Orco）通过形成异质二聚体在嗅觉感受中发挥关键作用,其中Orco由于具有序列的保守性而受到广泛的重视。本研究旨在克隆棉铃虫齿唇姬蜂 Campoletis chlorideae 的Orco基因,并对其组织表达谱进行分析。【方法】利用RT-PCR技术和转录组分析技术克隆棉铃虫齿唇姬蜂的Orco基因,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用Real-time PCR技术对该基因在该蜂成虫不同组织中的表达量进行分析。【结果】获得了棉铃虫齿唇姬蜂 Orco 的全长cDNA序列,命名为 CchlOrco（GenBank登录号：KP255444）。序列分析表明, 该基因开放阅读框全长1 437 bp,编码478个氨基酸,预测该氨基酸序列具有7个跨膜区。CchlOrco 主要在成虫触角中表达,且在雄蜂触角中的表达量最高,是雌蜂触角中表达量的8.0倍,而在其他组织中表达量极低。【结论】本研究克隆了棉铃虫齿唇姬蜂 CchlOrco 序列全长,明确了其在成虫不同组织中的表达水平,为进一步研究该基因及其他嗅觉受体基因功能奠定了基础。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

桃蛀螟成虫Orco嗅觉受体基因的克隆及组织表达谱分析

【目的】克隆桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)的Orco嗅觉受体基因, 并研究其在不同组织的表达谱。【方法】利用PCR技术克隆桃蛀螟触角Orco基因, 对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR技术分析该基因在的表达量。【结果】获得桃蛀螟成虫Orco的cDNA全长序列, 并命名为CpunOrco（GenBank登录号： JX101681）。该基因的开放阅读框全长1 425 bp, 编码475个氨基酸, 序列中有7个跨膜区。对桃蛀螟成虫不同组织中CpunOrco的荧光定量PCR结果表明, CpunOrco主要在触角和下颚须中表达, 雄虫触角中的表达量高于雌虫, 并且该基因在其他组织中也有一定的表达。【结论】本研究明确了该嗅觉受体基因在桃蛀螟成虫不同组织内的表达水平, 为进一步研究其功能提供了理论依据。