PKCα抑制生肌素转位及nAChR基因表达

 烟碱样乙酰胆碱受体 (nAChR)的表达调控受神经电活动影响 ,电刺激引起肌细胞膜去极化可抑制nAChR的表达 .以往的研究表明 ,Ca2 +和PKC以及生肌素在其中发挥着重要的作用 .然而 ,目前尚不清楚究竟是哪种PKC亚型参与此过程 ,PKC激活对特异转录因子生肌素浆核转位有何影响 ?为探讨PKC在去极化 nAChR转录偶联中的作用 ,构建了含nAChRγ亚基启动子的绿色荧光蛋白 (GFP)表达载体pEGFP γ ,将其分别与 4种cPKC(PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ)真核表达载体共转染C2C12肌细胞 .结果发现PKCβⅠ、PKCβⅡ对nAChRγ启动子驱动的GFP报告基因表达没有影响 (P >0 .0 5 ) ,PKCγ对报告基因表达有抑制作用 (P <0 .0 5 ) ,PKCα则有明显抑制作用 (P <0 .0 1) .采用 4种cPKC真核表达载体与GFP 生肌素融合蛋白表达载体 (pGFP myog)共转染C2C12肌细胞 ,观察了不同亚型PKC表达对生肌素浆至核转位的影响 ,发现只有强制性表达外源性PKCα可明显抑制生肌素向核中转位 ,而PKCβⅠ、PKCβⅡ及PKCγ对生肌素浆核转位没有明显抑制作用 .结果提示 ,PKCα通过抑制生肌素转位是阻遏nAChR基因表达机制之一 .     

MLP增强生肌素对nAChRγ亚基基因启动子的结合活性

构建表达GAL4 MLP融合蛋白的真核表达质粒pBind MLP .哺乳动物细胞双杂交试验表明 ,MLP与生肌素E12复合物存在细胞内的相互作用 .构建表达GST融合蛋白GST MLP和GST E12的原核表达质粒pGEX 2TK MLP以及pGEX 4T 2 E12 .在E .coliBL2 1中诱导表达GST MLP、GST 生肌素和GST E12 ,并用亲和层析法纯化了这 3种GST融合蛋白 .这 3种GST融合蛋白进行的凝胶阻滞试验表明 ,MLP可以增强生肌素 E12复合物对AChRγ亚基基因启动子的结合活性 .研究初步阐明了MLP增强nAChRγ亚基基因启动子在分化C2C12细胞中的转录活性的分子机制 .     

鸡骨骼肌发育过程生肌素的表达

ＭｙｏＤ家族生肌因子ＭｙｏＤ、生肌素（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ｍｙｆ－５和ｍｙｆ－６／ｈｅｒｃｕｌｉｎ对脊椎动物肌细胞分化和骨骼肌系统的发育成熟具有重要意义,其中生肌素的作用尤为突出,是肌细胞终末分化的关键因素。采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术检测鸡胚骨骼肌发育过程中生肌素在转录水平的表达动力学,发现在胚胎发育第９ｄ已有鸡肢体骨骼肌生肌素ｍＲＮＡ表达,第１３ｄ达到高峰,第１５ｄ开始下降,第１８ｄ至出生后两周几无可检测的ｍＲＮＡ;而生肌素蛋白则在胚胎发育第１３ｄ方可被检测到,第１５～１８ｄ达到高峰,至出生后两周仍维持在一定水平,表明生肌素的表达存在翻译和翻译后水平的调控。利用鸡生肌素基因上游－２２３／＋４０调控片段为探针对发育不同时期的鸡肌肉组织细胞核抽提物进行Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析。发现一种约３５ｋＤ的核内蛋白与探针有较强结合,结合活性第９ｄ时出现,至第１８ｄ达到峰值,出生后两周时降至难检测水平;另外有一种约１１ｋＤ的核内蛋白的ＤＮＡ结合活性恰好在转录活性下降的第１５～１８ｄ发生,按此情况两种核因子可能对生肌素的转录激活分别起正负调控作用。     

卵泡闭锁与其tPA,LH受体及抑制素α,βA亚基基因表达的关系

用DNA 3′-末端标记、免疫组化和原位杂交方法,通过连续切片比较研究了相同卵泡颗粒细胞抑制素亚基和LH受体(LHR)与卵细胞tPA表达和卵泡闭锁的关系.实验结果表明:(1) 卵泡闭锁伴随卵细胞tPA活性明显增加;(2) 颗粒细胞抑制素的产生调节卵细胞tPA活性的表达并与卵泡发育状态密切相关;(3) 卵泡闭锁时,颗粒细胞几乎不表达LHR和抑制素亚基.上述结果提示:卵细胞的tPA在闭锁卵泡中可能参与卵细胞的自我瓦解和清除过程;颗粒细胞表达的抑制素可能是tPA mRNA翻译的一种抑制因子,如其表达受阻,可导致卵细胞tPA蛋白活性增加引起卵泡闭锁.     

蛋白激酶C在血管紧张素Ⅱ抑制心肌细胞——氧化氮合成中的作用

实验用硝酸还原酶法测定培养新生大鼠内肌细胞亚硝酸盐（ＮＯ２）和硝酸盐（ＮＯ３）总量（ＮＯ２／ＮＯ３）,反映心肌细胞一氧化氮（ＮＯ）生成情况,观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）对凡肌细胞ＮＯ生成的及其蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）在该效应中的作用。结果显示：ＡｎｇⅡ可减少心肌细胞ＮＯ的含量,并具有明显的剂量－效应关系;ＡｎｇⅡ受体拮抗剂ｓａｒａｌａｓｉｎ可明显抵制ＡｎｇⅡ对ＮＯ生成的影响;Ｌ－精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ）明     

卵泡闭锁与其tPA，LH受体及抑制素 α，βA亚基基因表达的关系

用DNA 3′-末端标记、免疫组化和原位杂交方法,通过连续切片比较研究了相同卵泡颗粒细胞抑制素亚基和LH受体（LHR）与卵细胞tPA表达和卵泡闭锁的关系.实验结果表明（1） 卵泡闭锁伴随卵细胞tPA活性明显增加;（2） 颗粒细胞抑制素的产生调节卵细胞tPA活性的表达并与卵泡发育状态密切相关;（3） 卵泡闭锁时,颗粒细胞几乎不表达LHR和抑制素亚基.上述结果提示卵细胞的tPA在闭锁卵泡中可能参与卵细胞的自我瓦解和清除过程;颗粒细胞表达的抑制素可能是tPA mRNA翻译的一种抑制因子,如其表达受阻,可导致卵细胞tPA蛋白活性增加引起卵泡闭锁.     

CNTF对NMDA引起大鼠海马神经元蛋白激酶C核转位的影响

目的：探讨睫状神经营养因子(CNTF)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)引起大鼠海马神经元蛋白激酶C(PKC)发生核转位的影响。方法：以NMDA及CNTF处理原代培养的大鼠海马神经元,PKCγ、免疫细胞化学并结合图象分析方法测定PKC阳性神经元胞核的灰度。结果：①给予不同浓度NMDA处理不同时间后,神经元核内有不同程度的PKCγ及PKCε表达,其中以100μmol／L NMDA 30min组表现尤为显著;②CNTF 500μmol／L NMDA组神经元胞核PKC灰度与对照组相似。结论：NMDA可引起海马神经元PKCγ、PKCε的核转位,而CNTF则抑制其转位的发生,提示CNTF对海马神经元的保护作用与抑制PKC的核转位右关。     

蛋白激酶C在血管紧张素Ⅱ抑制心肌细胞一氧化氮合成中的作用

实验用硝酸还原酶法测定培养新生大鼠心肌细胞亚硝酸盐 (NO 2 )和硝酸盐 (NO 3)总量 (NO 2 /NO 3) ,反映心肌细胞一氧化氮 (NO)生成情况 ,观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对心肌细胞NO生成的影响及其蛋白激酶C (PKC)在该效应中的作用。结果显示 :AngⅡ可减少心肌细胞NO的含量 ,并具有明显的剂量 效应关系 ;AngⅡ受体拮抗剂saralasin可明显抑制AngⅡ对NO生成的影响 ;L 精氨酸 (L Arg)明显增加心肌细胞NO的浓度 ,此效应可被一氧化氮合酶 (NOS)抑制剂L NAME所抑制 ,L Arg未能消除AngⅡ抑制NO的作用 ;用佛波酯 (PMA)处理心肌细胞 ,其NO的生成明显减少 ,L NAME可加强此抑制效应 ;PKC抑制剂staurosporine (Stau)可明显削弱AngⅡ抑制心肌细胞NO生成的效应。结果提示 :AngⅡ具有抑制心肌细胞NO生成的作用 ,此作用可能是通过抑制心肌细胞NOS的活性而实现的 ;AngⅡ受体介导AngⅡ抑制心肌细胞NO生成的作用 ;激活PKC可使新生大鼠心肌细胞NO生成减少 ,NOS参与此抑制效应 ,新生大鼠心肌细胞NO生成过程的信号转导通路可能与PKC有关 ;PKC参与AngⅡ抑制心肌细胞NO的生成。     

生肌素引起组蛋白H3和H4高度乙酰化及染色质溶解性增加

为研究生肌素在染色质重建过程中的作用 ,采用生肌素真核表达载体转染C2C12肌细胞 ,细胞核经微球菌核酸酶消化后 ,提取DNA进行SDS PAGE分析 .生肌素转染的细胞 ,其核小体 (染色质 )在Mg2 + 溶液中的溶解性明显增加 ,提示染色质组蛋白乙酰化程度提高 .组蛋白经TAU SDS(2 D)双相凝胶电泳分析 ,发现在转染生肌素真核表达载体 2 4h后 ,组蛋白H4的乙酰化修饰程度最高 .采用抗乙酰化组蛋白H3和H4抗体进行的Western印迹分析进一步证明了乙酰化的发生 .上述变化与染色质的活跃程度相关 .RT PCR结果显示 ,生肌素的靶基因烟碱样乙酰胆碱受体 (nAChR)α亚基和肌酸激酶 (MCK)基因在转染后表达水平提高 .结果提示 ,强制性表达外源性生肌素可引起肌细胞核染色质重建 ,进而激活靶基因     

芳香烃受体核转位蛋白的结构及相关功能

芳香烃受体核转位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT）是碱性螺旋-环．螺旋转录因子超家族中新发现的PAS亚家族的成员之一。它是体内许多bHLH-PAS蛋白共同的专性配偶体,可以与芳香烃受体、低氧诱导因子、果蝇SIM蛋白等形成异二聚体并介导许多信号转导过程,从而使个体对环境污染物（如二恶英）、低氧状态等外界因素的改变产生相应的生物学效应,本文就ARNT的基本结构及其在体内的主要生理功能等方面作一综述。     

肌肉LIM蛋白增强生肌素对AChRγ启动子的反式激活作用

采用RT PCR技术克隆了大鼠肌肉LIM蛋白 (MLP) 6 40bp的全长cDNA序列 .以此cDNA为探针进行的Northern印迹表明 ,MLP于C2C12细胞在分化的第 3d至第 5d表达 .将MLPcDNA亚克隆至pcDNA3,构建真核表达质粒pcDNA3 MLP ,同时构建AChRγ启动子序列 (96 0bp)调控的荧光素酶报告基因真核表达质粒pGL3 γ .C2C12细胞转染及荧光素酶活性分析表明 ,复合转染pcD NA3 MLP和pGL3 γ的分化肌细胞表达的荧光素酶活性约为对照的 4倍 ;而在 3T3或未分化肌细胞复合转染pcDNA3 MLP和pGL3 γ均未检出报告基因表达 ,说明MLP可促进生肌素对AChRγ亚基基因启动子的反式激活作用 .     

低氧预适应增加小鼠脑组织内nPKCε膜转位

目的:初步探讨新奇型蛋白激酶C(novel protein kinases C,nPKCs)在脑低氧预适应发生发展过程中的作用.方法:利用蛋白电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)等生化技术,并结合本室已建立的小鼠低氧预适应模型,观察低氧预适应对小鼠海马和大脑皮层组织内nPKCs(nPKCε、δ、η、μ和θ亚型)膜转位(激活)的影响.结果:随低氧次数(H0-H4)或低氧耐受时间的增加,小鼠海马(H0:41.6%±1.4%vs H1-H4:46.9%±4.5%,52.7±3.9%,58.8%±2.7%,61.3%±3.7%)和大脑皮层(H0:38.4%±4.5%vsH1-H4:42.4%±5.0%,48.7%±6.5%,55.3%±8.9%,61.2%±10.2%)组织内nPKCε膜转位明显增加,且海马和大脑皮层分别在H2、H3、H4和H3、H4具有统计学的显著意义(P＜0.01);而nPKCδ、η、μ和θ亚型在海马和大脑皮层组织内的膜转位变化均无统计学意义.结论:nPKCε可能在脑低氧预适应的发生发展过程中发挥着重要作用,但需进一步的研究证实.     

抑制素α基因表达下调对鹅卵泡颗粒细胞凋亡和增殖的影响

抑制素α基因是控制家禽排卵率的一个重要候选基因。为研究抑制素α基因对体外培养的鹅卵泡颗粒细胞增殖凋亡的遗传作用,构建psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2两个抑制素α基因干扰载体,以降低抑制素α基因表达。体外培养鹅F1和闭锁卵泡的颗粒细胞,经抑制素α基因干扰48h后,荧光显微镜检测转染效率,同时用流式细胞术检测抑制素α基因表达水平,以及细胞生长周期、细胞凋亡指数和增殖指数的变化,用放免法测定细胞培养上清中雌激素和孕酮水平。结果表明,抑制素α基因干扰后卵泡颗粒细胞抑制素表达水平比对照组降低30%～40%（P〈0.05）;细胞凋亡指数和增值指数显著高于对照组（P〈0.05）;细胞分泌雌激素水平显著下降（P〈0.05）。由此推断,抑制素α基因对颗粒细胞具有显著的抗凋亡效应。     

一氧化氮抑制血管紧张素Ⅱ和内皮素-1诱导的心肌细胞原癌基因c-fos表达

在原代培养的新生大鼠心肌细胞上, 探讨一氧化氮 (NO)对血管紧张素Ⅱ (AⅡ)和内皮素-1 (ET-1)诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达的影响.用Bradford 法测定心肌细胞总蛋白含量 (作为心肌细胞肥大的指标); 用基因特异性引物和 SuperScript一步法进行逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR), 检测大鼠心肌细胞原癌基因c-fos的表达 (以GAPDH为内标).结果显示, AⅡ和ET-1分别作用5 d和3 d后, 心肌细胞总蛋白含量显著增加; 硝普钠 (NO供体)可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞总蛋白增加.AⅡ,ET-1和PMA (蛋白激酶C激动剂)均可诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达; L-精氨酸可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达, L-NAME (NOS抑制剂)可抑制L-精氨酸的这一作用; 硝普钠对可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达.结果表明, NO可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达, 其作用机制可能与蛋白激酶C这一环节有关.     

控制序列和基因表达

1981年4月5-8日将在苏格兰安德鲁布举行这次学术会议,讨论的问题有:1)质体的遗传组构和表达;2)、原核和真核基因组中的控制序列(或要素);3)转位遗传     

TSA通过抑制STAT1磷酸化与核转位下调人肝癌细胞HepG2内 IDO的表达

目的:研究曲古抑菌素A (Trichostatin A, TSA)下调γ干扰素(interferon-gamma, IFN-γ)诱导的人肝癌细胞HepG2内吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO)表达的分子机制。方法: Western blot 检测TSA在IFN-γ诱导的HepG2细胞中IDO的表达、信号转导及转录激活子1(STAT1)的磷酸化和干扰素调节因子1(IRF-1)的诱导表达情况。用免疫细胞化学法检测TSA处理HepG2细胞后对IDO表达的影响。流式细胞术分析TSA处理后IFN-γ受体2表达量的变化,进一步在激光共聚焦显微镜下观察TSA对STAT1核转位的影响,利用双荧光素酶报告基因系统检测TSA对IFN-γ激活位点(γ-activated sites, GAS)、干扰素刺激应答元件(interferon stimulated response elements, ISRE)和核因子-κB (NF-κB)的激活的影响。结果:TSA以剂量依赖方式下调HepG2细胞内IFN-γ诱导的IDO表达、能明显抑制STAT1第701位酪氨酸的磷酸化和STAT1的核转位,但是上调IFN-γ受体2受体的表达。双荧光素酶报告基因分析和Western blot结果表明:TSA能显著抑制GAS和IRF-1 的激活却不能抑制NF-κB和ISRE的激活。 结论:TSA能下调IFN-γ诱导的HepG2细胞中IDO的表达,其机制可能是与其抑制STAT1的磷酸化和核转位,以及抑制STAT1与GAS的结合有关,而不是通过下调IFN-γ受体的表达来实现的。     

蛋白激酶C对CNE-2Z细胞p53基因表达的影响

用抗人ｐ５３蛋白单抗,进行免疫细胞化学染色,研究了蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）对ＣＮＥ－２Ｚ细胞ｐ５３基因表达的影响。结果发现：对照组Ｐ５３蛋白阳性细胞百分比为６７．６９±２．９７。ＰＫＣ催化区抑制剂Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴ）和调节区抑制剂Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（ＳＳ）终浓度分别为２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ和４×１０－５ｍｏｌ／Ｌ诱导细胞２４ｈ后,Ｐ５３阳性细胞百分比分别为３０．４４±４．２５和２９．１９±２．３９,较对照组均明显降低,Ｐ＜０．０１。用终浓度为２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ的ＴＰＡ和终浓度为４ｕｇ／ｍｌ的ＯＡＧ分别作用２４ｈ后,Ｐ５３阳性细胞百分比分别为３３．７５±４．３４和６８．１８±４．４２,前者较对照组明显降低,Ｐ＜０．０１,后者变化不明显。阳性细胞中对照组和ＯＡＧ组以胞核和胞浆均着色为主,而ＳＳ、ＳＴ和ＴＰＡ组以胞核着色为主。以上结果表明：突变型ｐ５３基因在ＣＮＥ－２Ｚ细胞中有较高表达;通过抑制细胞ＰＫＣ活性和耗竭ＰＫＣ含量后,均可降低ｐ５３基因的表达;ＰＫＣ激活剂ＯＡＧ对该细胞ｐ５３基因的表达无明显影响。     

一种新发现的肌特异基因表达调节因子：心肌素

心肌素是一种新发现的特异性调节心肌和平滑肌基因表达的蛋白因子 ,与血清效应因子(SRF)一起构成肌细胞分化分子开关的组成成分。心肌素在胚胎及成年心肌和平滑肌细胞中均进行表达 ,是这两类细胞基因特异性表达及分化所必需的转录激活因子。本文就心肌素的结构特征及其调节肌特异基因表达的分子机制进行综述