有益芽孢杆菌受体菌研究

采用酸性茚三酮法测定了30株有益芽胞杆菌的赖氨酸产量,然后在不同的溶菌酶浓度下,对赖氨酸产量超过0．07g/L的21株菌进行原生质体转化质粒pUB110,测定原生质体形成率、原生质体再生率及转化频率,结果6103,6104,6120,6129四株菌的转化频率较高。最后,采用经典遗传学方法选育AEC抗性突变株,使赖氨酸积累提高。其中,B.licheniformis 6104诱变菌株610401能积累赖氨酸2．91g/L ,比出发菌株提高了17倍左右,转化率也提高了一个数量级。通过质粒的再转化试验及传代稳定性试验,进一步证实B.licheniformis 6104及其 突变菌株610401是较好的受体菌,尤其是用于赖氨酸合成酶基因的表达。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

产紫杉醇菌株原生质体诱变育种的研究

对紫杉醇产生菌NCEU-1的原生质体进行了紫外线和氯化锂复合诱变,筛选制霉菌素抗性突变株,共筛选出了4株正突变株。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的原生质体诱变菌株——UL_04-5,其紫杉醇产量从出发菌株的314.07μg/L提高至418.24μg/L。     

地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率,为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体,以SMMP作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100mg/mL,37℃下酶解30min,原生质体生成量可达8×109个/mL;再生培养基选用含1mol/L琥珀酸钠的DM3时,再生率最高可达17%。在此条件下,采用PEG法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.lichenifor-mis303,转化率可达10~15 CFU/μg DNA。     

产L-谷氨酸工程菌株的诱变选育及其发酵效率

以高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌GY1为研究对象,采用ARTP进行全局诱变,进一步提高L-谷氨酸的发酵水平。首先,对谷氨酸棒杆菌GY1原生质体的制备及再生条件进行优化,接着,根据致死率选择最佳的ARTP处理时间,然后,采用96微孔板及摇瓶发酵的方式对突变株进行筛选,最后,对获得的优良突变株进行50 L罐发酵验证。结果显示,溶菌酶浓度为10.0 mg/mL,酶解90 min,原生质体形成率和再生率达到最佳。ARTP最佳处理时间为40 s,致死率达到89.6%,经过初筛与摇瓶复筛,获得突变株YAG117,其摇瓶发酵L-谷氨酸含量达16.3 g/L,较出发菌株提高13.9%,且连续传代五代遗传稳定。50 L补料分批发酵条件下,L-谷氨酸产量在36 h最高,达到216.6 g/L,较出发菌株提高12.9%,糖酸转化率达68.87%,比出发菌株提高了10.2%。ARTP处理GY1菌株原生质体,能够有效积累有利突变,提高突变株发酵生产L-谷氨酸的能力,获得的突变株YAG117也显示了较好的工业化应用潜力。     

费氏丙酸菌维生素B_1营养缺陷型菌株的诱变选育

在丙酸发酵过程中,乙酸为主要副产物,维生素B1与乙酸合成途径相关,筛选维生素B1营养缺陷型突变株有助于降低乙酸的合成,提高丙酸的产量。以费氏丙酸菌IFFI.10019作为出发菌株,经过紫外线诱变处理,筛选育种获得维生素B1营养缺陷型费氏丙酸菌二株,其中Pf007菌株的丙酸产量由原来的1.1 g/L提高到2.1 g/L,提高率达到91%。     

利用淀粉直接发酵生产肌苷菌株的构建

以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TF_2为受体菌,利用质粒DNA的原生质体转化法,将携带糖化型α-淀粉酶基因的重组质粒pBX96导入肌苷产生菌TF_2中,转化频率为5.7×10^(-6),获得一株能以淀粉为碳源生产肌苷的转化子T140(pBX96),该工程菌株能在以淀粉为碳源的培养基上平均积累肌苷4.64g/L,经过92代,质粒自发丢失率为0.78％。培养48h后,工程菌株的糖化型α—淀粉酶活力为受体菌的7.79倍。并对工程菌株TI40(pBX96)的发酵条件做了初步摸索。     

磷脂酶D高产菌株的原生质体紫外诱变选育

为了获得磷脂酶D高产菌株,由链霉菌野生菌株LD0501出发研究原生质体的制备和再生条件,建立原生质体紫外诱变筛选方案。采用酶解法制备原生质体,用紫外线对原生质体诱变,TLC检测突变株产磷脂酶D活力。原生质体的适宜条件:种子培养基中甘氨酸质量浓度5 g/L,菌龄72 h,用3 mg/m L的溶菌酶在30℃下酶解75min。通过原生质体诱变筛选,得到1株高产菌株,磷脂酶D水解活力达4.29 U/m L,提高幅度为180.4%。该方法有效改善了链霉菌野生菌株原生质体的制备效果,紫外诱变筛选显著提高了磷脂酶D的活力,高产突变株具有较好的稳定性。     

透明颤菌血红蛋白基因在地衣芽孢杆菌ATCC9945a中的表达及作用

目的:研究透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在产聚γ-谷氨酸(γ- PGA)的地衣芽孢杆菌ATCC9945a中的表达及对其生物量和产量的影响.方法:以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭表达载体pUBC19为骨架,构建含有枯草芽孢杆菌的组成型启动子P43和透明颤菌血红蛋白结构基因的穿梭表达载体pUBC19 - PV,并通过电击转化得到重组的产γ-PGA的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis).一氧化碳差光谱验证重组B.licheniformis 中是否表达了有活性的血红蛋白.摇瓶发酵试验研究重组菌株和对照菌株生物量和发酵产物产量的变化.结果表明,重组菌株的生长明显比对照菌株快,但是γ - PGA的产量却比原始菌株低:在正常供氧时,其产量12.8g/L,比亲株产量21.7g/L下降了41%,贫氧环境下产量8.8g/L,比亲株产量12.8g/L降低了31%.结论:vgb 在重组菌株中表达了有活性的的透明颤菌血红蛋白,并可以促进细胞的生长,但聚谷氨酸的产量却有所下降.文章针对聚γ-谷氨酸产量的下降原因进行了讨论,并对下一步的工作提出了建议.     

纤维素酶高产菌株Trichoderma atroviride HP35-3原生质体制备及转化

旨在优化深绿木霉(Trichoderma atroviride)菌株HP35-3原生质体制备和转化条件,便于对该菌株进行遗传操作以提高其纤维素酶产量。分别对制备深绿木霉原生质体的菌龄、酶解时间、酶组分及比例和转化条件进行优化。结果显示,利用3mg/m L蜗牛酶、3 mg/m L溶菌酶和3 mg/m L裂解酶酶组分酶解菌龄10 h的菌丝2 h,获得的原生质浓度达到3.5×107个/m L以上,原生质体再生率为61%。利用原生质体进行PEG介导转化,当原生质体浓度为1×108个/m L、外源DNA为5μg时,转化率达到35个转化子/μg DNA。建立的高效原生质体制备及转化体系可用于深绿木霉的遗传转化及菌株改造。     

通过原生质体质粒转化提高Streptomyces actuosus诺西肽产量的研究

研究利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSE34,构建vhb基因的重组质粒pSEVhb,采用原生质体质粒转化法,将携带vhb的重组质粒转入诺西肽产生菌Streptomyces actuosus中,获得重组菌S.actuams/pSEVhb.通过CO结合试验,证明VHb在重组菌中成功表达.限氧试验表明,重组菌S.ac-tuosus/pSEVhb诺西肽的的产量明显高于出发菌株.传代试验重组菌稳定,适合工业化大生产.     

利用紫外线、利福平、氯化锂诱变原生质体筛选L—亮氨酸高产菌株的研究

本实验是以黄色短杆菌T_(6—13)的诱变株L—亮氨酸产生菌D—R—4为出发菌株,经青霉素、甘氨酸、溶菌酶作用制备原生质体,形成率达91.30％,再生率达53.68％;然后对原生质体进行紫外线、利福平、氯化锂复合诱变处理;在再生培养基平皿上培养,获得再生突变株,从中挑取单独菌落,进行摇瓶发酵筛选,已选育出一株57—4S号高产稳定菌株;经氨基酸分析仪测定其发酵液L—亮氨酸产量由出发菌株的17.35mg/ml提高到23.45mg/ml提高了35％。发酵液中主要副酸——异亮氨酸含量很少。     

纳他霉素产生菌原生质体的制备、再生及紫外诱变

研究了纳他霉素产生菌原生质体的最佳制备和再生条件,及此基础上的紫外诱变育种.初步确定了原生质体制备和再生的适宜条件为:菌龄48h,采用0.4%溶菌酶在30℃处理90min.原生质体再生后,73.3%的菌种产量得到了提高,其中5-12菌株增产74.7%,达到2121.2μg/mL.原生质体经紫外线诱变后得到的5株诱变菌株产量均有提高,其中菌株UV-2增产107.09%,达到2515.07μg/mL.     

基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌

以琥珀酸产生菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌,分别经过紫外线-甲基磺酸乙酯(UV-EMS)和紫外线-硫酸二乙酯(UV-DES)诱变处理,得到7株耐酸性有所提高的突变株.以此作为候选菌库,经3轮原生质体递进融合,筛选获得4株可以在pH 5.6下生长的改组菌株.其中改组菌株F3-21在pH 5.6的完全液体培养基中生长的OD值是原始菌的7倍,在pH 5.2条件下仍能生长;其摇瓶发酵48h琥珀酸产量较原始菌株提高48%.在5L发酵罐中进行分批发酵,当控制pH在较低值(5.6～6.0)时,F3-21厌氧发酵48h积累琥珀酸38.1g/L,较出发菌株提高了45%;当控制pH在6.5～7.0时,F3-21厌氧发酵32h积累琥珀酸40.7g/L.F3-21在5L发酵罐中进行补料分批发酵,厌氧发酵72h,产琥珀酸达67.4g/L.结果说明基因组改组技术能够改进琥珀酸放线菌的耐酸性能及其琥珀酸的产量.     

D-核糖生产菌的原生质体诱变及其发酵培养

目的:筛选出莽草酸、转酮醇酶双重营养缺陷型的D-核糖生产菌枯草芽胞杆菌,以提高D-核糖的产量。方法:采用化学诱变剂乙基磺酸甲烷(EMS)对野生型D-核糖生产菌的原生质体进行诱变,并从D-核糖合成途径对发酵培养基进行优化设计。结果:摇瓶发酵D-核糖平均产量为52.2g/L;获得的B.sems-10菌株具有良好的遗传稳定性,D-核糖产量高达67.5g/L。结论:通过对D-核糖生产菌原生质体的EMS诱变,筛选出了高产、遗传性状稳定的营养缺陷型B.sems-10菌株,为进一步提高产量奠定了基础。     

谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中metX基因编码蛋氨酸合成途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶,dapA基因编码赖氨酸合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶。为研究这两个基因缺失对苏氨酸积累的影响,以谷氨酸棒杆菌R102(AHVr)为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建了metX、dapA单基因缺失突变株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及双基因缺失的突变株R102ΔmetXΔdapA。对出发菌以及上述3株重组菌进行初步摇瓶发酵试验,用HPLC法测定发酵液中苏氨酸含量。结果表明,发酵72 h后,3株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58、2.38和3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%和66.3%。     

紫杉醇高产菌株的原生质体诱变选育及其遗传变异初探

以紫杉醇产生菌NCEU_1为出发菌株,分别采用紫外线和紫外线与氯化锂复合诱变方法对其原生质体进行诱变,获得了两株高产紫杉醇的突变株———UV4 0 - 1 9和UL50 - 6 ,其紫杉醇产量从出发菌株的314 0 7μg L分别提高至376 38μg L和392 6 3μg L ;同时,又采用RAPD和同工酶技术对出发菌株NCEU_1与两高产株UV4 0 - 1 9和UL50 - 6 间的遗传差异进行了研究。结果表明,出发菌株与诱变菌株之间以及两诱变菌株之间都存在明显差异,为进一步研究与紫杉醇合成相关基因及诱变株产量提高的分子机制奠定了基础     

利用原生质体技术选育聚β—羟基丁酸高产菌株的研究初报

从城市生活污水中分离筛选到1株浮游球衣细菌（Sphaerotilus natans)。以浮游球细菌G-8菌为出发菌株,采用甘氨酸-溶菌酶-EDTA方法,研究了各种因素对原生质体形成和再生的影响。在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体,G-8菌原生质体形成率和再生率分别达96.8%和29.8%。该菌株能在自然pH(pH6-7)和29℃条件下良好生长,细胞可大量积累聚β-羟基丁酸（PHB）,从对数期到稳定期,该菌积累的PHB量可达68g/L。     

Breeding of ε-poly-L-lysine producing strain using succinic acid as sole carbon source

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线菌ε-PL的产量.以稠李链霉菌Streptomyces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性.经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0.68 g/L,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定.H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2.0 g/L,较出发菌提高了一倍.在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LSL5的PEP羧化酶酶活提高了1.67倍.     

用基因组重排技术选育赖氨酸高产菌株

摘要：【目的】以北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）1为研究对象,选育赖氨酸高产菌株,并探索赖氨酸产生菌基因组重排育种的基本规律。【方法】利用基因组重排技术选育赖氨酸高产菌株。【结果】通过四轮基因组重排成功选育出了5株遗传稳定的高产赖氨酸菌株,其中1株重排菌株赖氨酸产量达到16.95 g/dL,比原始菌株Corynebacterium pekinense 1赖氨酸产量提高了37.14%,比亲本菌株赖氨酸产量提高了17.46％~31.19%。【结论】首次采用基因组重排技术改良赖氨酸产生菌,成功选育出了5株产量较稳定的高产赖氨酸菌株,具有潜在的应用价值。