双歧杆菌质粒聚合酶基因对质粒载体稳定性的影响

目的探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因（Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP）对人工构建的大肠埃希菌～双歧杆菌穿梭质粒载体（shuttle vector）在长双歧杆菌中稳定性的影响。方法首先电转化质粒pBADs—A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养鉴定后,接种含质粒pBADs—A和pBADs-BPP的双歧杆菌于AMP^-和AMP^＋的MRS培养液中。厌氧培养后,将样品涂布于AMP^＋的MRS固体培养板上计数菌落数。结果相同条件下质粒pBADs·BPP组菌落数高于质粒pBADs—A组（P〈0．05）。结论BPP可以增加质粒载体的稳定性。     

口服狂犬病疫苗

口服狂犬病疫苗根据毒种类型分为二类：一类为减毒活疫苗，首先美国用ＥＲＡ株在实验室研究成功，随后各国相继研究ＳＡＤ株的突变株ＳＡＤＢｅｒｎ（或ＳＡＤｓｗｉｓｓ），ＳＡＤＢ＿１９、ＳＡＧ＿１以及ＣＴＮ—１株口服狂犬病疫苗，均获得较好的口服免疫原性，对动物ＳＡＤＢｅｒｎ、ＳＡＤＢ＿１９、ＳＡＤｓｗｉｓｓ、ＣＴＮ—１的毒性相近，而ＳＡＧ＿１的毒性最弱，对多种成年野生动物不致病。以上各株病毒分别被制成口服疫苗在世界许多地区得到试验和应用。另一类为重组基因工程口服疫苗，已将狂犬病毒的糖蛋白基因分别重组到人腺病毒５型，痘苗病毒、浣熊痘病毒、金丝雀痘病毒、多角体病毒中，并证实均有免疫原性，重组痘病毒ＶＶＴＧｇＲＡＢ制备的口服疫苗已在比利时进行大规模的区域性试验，具有有效性、无毒性和热稳定性。口服疫苗的诱饵多采用鸡头、蜡制或膨化食物外壳内包装有疫苗胶囊的复合体。     

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ,ＣＳＦＶ）主要保护性抗原Ｅ２基因４种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验表明,Ｅ２基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的Ｅ２基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的Ｅ２基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的Ｅ２基因则不能诱导产生ＣＳＦＶ特异性的免疫反应。攻毒保护试验表明,免疫家兔最     

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒.小鼠免疫试验表明,E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CSFV特异性的免疫反应.攻毒保护试验表明,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(MID)的猪瘟兔化弱毒苗(Hog cholera lap-inized virus, HCLV)的攻击;免疫猪可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

ChIL-2-ChIL-4融合基因重组质粒遗传稳定性研究

为研究大规模生产过程中DH5α/pUC57重组菌携带的表达鸡白细胞介素-2(ChIL-2)和白细胞介素-4(ChIL-4)融合基因质粒的遗传稳定性,探讨其作为鸡球虫活疫苗免疫佐剂的商业化批量生产的潜力,本文通过对重组质粒连续30代传代培养的方式,进行实验室遗传稳定性鉴定。研究结果显示:重组菌在含有氨苄青霉素(Amp+)的溶菌肉汤(LB)平板上传代30次均保持革兰氏阴性(G-),发酵葡萄糖及甘露醇并产生特异现象,但不发酵乳糖;重组菌与大肠杆菌16S rDNA片段的同源性均大于95%,各代重组质粒超螺旋比均大于90%,质粒丢失率均为0;重组质粒的表达产物具有刺激无特定病原体(SPF)雏鸡脾脏淋巴细胞的分化能力。结果表明,ChIL-2-ChIL-4融合基因重组菌和重组质粒30代内结构稳定、分离稳定,能够为扩大生产提供物质支持。     

基因重组菌质粒稳定性的提高与苯丙氨酸发酵的研究

本研究用具有苯丙氨酸生产抗反馈抑制基因pheA^FR、aroF^FR及温度敏感型阻遏基因CI857的质粒pSYl30—14和具有分配机能的低拷贝质粒pSYl6,重组构建了具有苯丙氨酸生产基因系统的质粒：psY200一14,然后使其转化到大肠杆菌AT2471中,育成了基因重组菌株AT247l／psY200—14。试验表明,该菌株质粒稳定性比原菌株AT2471／psYl30—14有较大的提高,当存在选择压时,在30～42℃范围内维持100％的高稳定性。应用此重组菌株,在2．5L通气搅拌罐进行发酵试验,在搅拌转速850rpm,通气速率1．Ovvm,38．5℃和pH7．O的条件下,发酵48h苯丙氨酸生成量达14．2g／L,比原株增产l1．8％。     

植物口服疫苗的研究进展

植物口服疫苗是通过转基因植物生产,通过口服的方式预防疾病的生物制品.作为一种新型疫苗,其研究开始于三十几年前.由于植物口服疫苗可以最大程度地降低传统疫苗的潜在风险,在疫苗生产中具有优势,因此拥有良好的商业生产前景.植物疫苗价格低廉,生产过程安全,可产生与注射疫苗相似效价效果,无论是在控制养殖业抗生素滥用的情况下作为替代...     

Coevolving Plasmids Drive Gene Flow and Genome Plasticity in Host-Associated Intracellular Bacteria

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不同保存条件下Wm84株腮腺炎减毒活疫苗的稳定性

采用留样观察法对Wm84株腮腺炎减毒活疫苗在不同保存条件和不同规格疫苗(1 mL/支21批、0.5mL/支24批)的稳定性进行了比较.结果表明不同规格疫苗的稳定性均较好,疫苗保存温度越低其稳定性越好.     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2E基因的稳定性

分别对SA14-14-2(PHK8代)疫苗株及其原野毒株SA14和另2个疫苗传代株[SA14-14-2(PHK17代)和SA14-14-2(鼠脑1代)]的E区基因进行了序列测定.结果表明,乙脑病毒减毒活疫苗SA14-14-2在PHK细胞上连传至17代时,发现2个氨基酸突变(E-331、E-398),但不是回复突变.虽然在毒力最容易返祖的乳鼠脑内传1代后发生E-107个氨基酸回复,但与野毒株毒力相比仍然相差很大,无毒力返祖现象.在疫苗的实际质控工作中,对上述与毒力相关的基因进行监测,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平,为疫苗安全性提供更可靠的检测手段.     

结核杆菌Ag85B基因疫苗的免疫保护效果研究

为研究结核杆菌Ag85B基因疫苗的免疫原性和免疫保护效果,将雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1( )组和PBS组.取各免疫组小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;同时进行CTL杀伤活性检测;进一步用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.结果表明,结核杆菌Ag85B基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-1分泌增加,IL-4分泌减少,CTL特异性活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻.     

牙龈卟啉单胞菌HA2基因和白细胞介素IL-15基因重组质粒的构建

构建抗牙龈卟啉单胞菌的牙周炎基因疫苗p VAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15,体外检测其在293T细胞的表达。以HA2基因(牙龈卟啉单胞菌牙龈素—血凝素基因编码区的核心功能区)为目的基因与IL-15基因为免疫佐剂构建真核表达质粒,用Lip2000介导瞬时转染293T细胞,RT-PCR检测目的基因mRNA水平及酶联免疫吸附试验检测IL-15蛋白表达水平。重组质粒p VAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15经酶切及DNA测序鉴定构建正确,转染的293T细胞能够检测到目的基因的表达,也可以检测到IL-15蛋白的表达。说明我们成功构建了真核共表达质粒pVAX1-HA2和p VAX1-HA2/IL-15,为下一步研制抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗奠定了基础。     

鸡新城疫病毒HeB02分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究

根据GenBank报道的鸡新城疫病毒F基因序列设计了一对引物,以鸡新城疫病毒HeB02分离株基因组为模板,通过RT-PCR扩增出了1·66kb左右的F基因片段,序列分析表明HeB02株F基因与国内标准强毒株F48E9及弱毒疫苗La Sota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88·1%、84·9%和83·8%。将HeB02株F基因插入真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达质粒pSV-F,通过脂质体转染COS-7细胞,SDS-PAGE分析可见表达的特异蛋白条带;Western blot、ELISA和中和试验检测结果表明:真核表达的蛋白与抗新城疫病毒的抗体发生特异性反应,说明F蛋白具有很好的免疫原性。采用活体电击法以真核表达质粒pSV-F免疫3周龄SPF鸡,剂量为50μg/只,3周后加强免疫1次,5周后以100倍鸡胚感染剂量(EID)的F基因同源病毒对所有鸡进行攻毒,攻毒前后每周分别以喉拭子进行病毒分离和HI效价测定。结果显示对照组在攻毒前一直没有检测到抗体效价,攻毒后检测效价为3·0log2±1·40,并且于攻毒后第9天全部死亡;活疫苗组和实验组免疫后第2周检测到抗体效价,第5周最高,HI效价分别为8·3log2±1·30和7·2log2±1·23,攻毒1周后HI效价分别达9·8log2±1·55和8·9log2±1·77,极显著高于对照组(P<0·01)。免疫组未分离到新城疫病毒,对照组全部分离到新城疫病毒。表明所构建的F基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。     

转基因番木瓜作为抗结核植物口服疫苗的初步研究

转基因植物疫苗的研制,可改变传统的疫苗接种方式和接种手段,大大降低疫苗的生产成本,具有广阔的应用前景。结核病的泛滥使抗结核的免疫预防急需开发新型的疫苗,研制抗结核的转基因植物疫苗具有重大的理论和实践意义。本文对具有良好免疫原性的结核杆菌分泌蛋白ESAT—6基因,进行了修饰改造,构建了带潮霉素选择抗性基因的植物表达载体和根癌农杆菌工程菌;采用叶盘法转化热带水果番木瓜,获得了13株抗性植株,通过PCR、Southern blot和RNA dot blot分子检测,确认了4株为转基因植株。番木瓜ESAT—6转基因植株的获得,为进一步的结核病植物口服疫苗的免疫研究和新型抗结核疫苗的研制与开发奠定了基础。     

葡萄糖异构酶基因工程菌的改造初探

葡萄糖异构酶（ｇｌｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ,ＧＩ）是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值．本文选择了表达载体ｐＢＶ２２０［１］,利用ＰＣＲ方法删除了原表达质粒ｐＴＫＤＧＩ１中ＧＩ结构基因５′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达ＧＩＧ１３８Ｐ的表达质粒ｐＢＺＧＩ１．传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系．粗酶液经热处理、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ和分子筛Ｓｅ…