L-色氨酸的生产方法

专利要求的范围 用节杆菌属(?一丈。,夕夕一)中对一种或二种以上的色氨酸类似物具有抗性的LO色氨酸产生菌,在培养液中积累色氨酸,并从该培养液中提取L一色氨酸的发酵生产法。 本发明详细池叙述了节杆菌属中的L一色氨酸生产菌,通过培养,从发酵液中分离、回收L一色氨酸的方法,由于采用了生成L一色氨酸能力高的菌株,所以使必须氨基酸中的L-色氨酸达到了兼价工业生产的要求。 过去发酵法生产L一色氨酸,采用的是在培养基中添加叫噪或邻氨基苯甲酸的方法,此法因必须采用高价的引噪或邻氨基苯甲酸作前休物质,使色氨酸的生产存在着成本高的缺点…     

色氨酸发酵的初步研究

我们从271株酵母菌中,选出一株可利用邻氨基苯甲酸为前体产生色氨酸的优良菌株——阿保利假丝酵母(Candida arborea AS 2．566)。对该菌的发酵条件进行了初步研究,发现通气量、邻氨基苯甲酸浓度等与色氨酸产量有密切关系。采用乙醇一邻氨基苯甲酸混合分次追加的方式,可提高色氨酸的产量。用30升发酵罐试验,色氨酸产量达5克／升以上。     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因(ASA2)作为筛选标记基因,并采用氨基酸的类似物5—甲基色氨酸为筛选剂,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高59％～123％。PCR检测转化子1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物(烟草)编码的邻氨基苯甲酸α—亚基能够与另一种植物(大豆)编码该酶的β—亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论。     

大肠埃希菌trp operon的克隆与表达

色氨酸操纵子所表达酶的高效表达和酶活性的提高,从而构建高产色氨酸菌株.利用PCR的方法从大肠埃希菌基因组中直接克隆色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pBV220-trp operon,转化大肠埃希菌DH5α,温度诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性.通过凝胶电泳观察PCR扩增产物大小约为7 kb.SDS-PAGE鉴定目的蛋白得到了高效表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.4倍和2.5倍.成功构建了重组质粒pBV220-trp operon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠埃希菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础.     

脱硫创新霉素对邻氨基苯甲酸合成酶活性的影响

<正> 用两种实验方法观察了脱硫创新霉素对ASase活性的影响。1.药物对E.coli BT36(Trp~- phe~- tyr~-)积累邻氨基苯甲酸的影响。发现脱硫创新霉素虽然部分抑制邻氨基苯甲酸的积累,却不出现分支酸的积累,而色氨酸在抑制邻氨基苯甲酸积累的同时出现分支酸积累。2.药物对ASase的作用。发现税硫创新霉素和创新霉素均不能抑制ASase活性,而色氨酸能显著抑制ASase活性,从而证明了脱硫创新霉素和创新霉素的抗菌作用不是通过反馈抑制色氨酸途径第一酶ASase的活性而实现的。     

头状轮生链霉菌芳香族氨基酸合成途径的调节

对头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)芳香氨基酸合成途径的研究表明,第一个酶即3—脱氧—α—阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶无同工酶,不被L-色氨酸阻遏,比活力可被硝酸盐促进。L-色氨酸强烈地反馈抑制此酶,L-酪氨酸和L-苯丙氨酸无作用。L-色氨酸的反馈抑制对磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是非竞争性的,K_I为373μmol/L。酶对PEP和4-磷酸亦藓糖(E4P)的K_m值分别为50和100μmol/L。PEP和C0²⁺对酶有稳定作用。邻氨基苯甲酸合成酶活力可被1mmol/L L-色氨酸完全抑制,此酶也受L-色氨酸的阻遏,但是色氨酸支路上其余4个酶不被阻遏。分支酸变位酶被L-酪氨酸抑制。L-苯丙氨酸抑制预苯酸脱水酶,并更强地抑制预苯酸脱氢酶。     

L-色氨酸的制取(发酵法)

<正> 发明的背景这项发明涉及到通过发酵制取L-色氨酸的方法作为必要的氨基酸之一,L-色氨酸是很有用处的。很需要寻找一种适以大规模生产的、经济实用的生产方法。通常,L-色氨酸在含有一种前体(例如,吲哚,邻氨基苯甲酸或丝氨酸)的培养基上通过发酵而制取。(如日本公开特许71-27353),或者     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸 ,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因 (ASA2 )作为筛选标记基因 ,并采用氨基酸的类似物 5-甲基色氨酸为筛选剂 ,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组 ,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高 5 9%～ 12 3%。PCR检测转化子 1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物 (烟草 )编码的邻氨基苯甲酸α 亚基能够与另一种植物 (大豆 )编码该酶的 β 亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论     

北京棒杆菌芳香族氨基酸转运蛋白基因敲除对L-色氨酸积累的影响

[目的]为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲除的菌株,研究aroP基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响.并进一步研究在aroP敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响.[方法]运用PCR技术扩增aroP基因,与整合质粒连接后,用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP基因的敲除载体.利用同源重组技术,敲除北京棒杆菌PD-67的aroP基因,构建菌株PD-67 ΔaroP,并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP进行互补验证.采用PCR技术扩增AS基因,与表达载体连接构建重组质粒.将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP,构建工程菌株PD-67 ΔaroP/pXAS.通过摇瓶发酵研究PD-67 AaroP和PD-67 ΔaroP/pXAS的发酵特性.[结果]经PCR验证获得了aroP基因缺陷的菌株.摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65％.酶活分析结果表明,AS基因在菌株PD-67 △aroP中得到表达.AS基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25.6％.[结论]北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因arop的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量.在arop基因敲除菌中表达AS基因,可以进一步提高工程菌的产酸率.     

芳香途径终产物和中间体对力复霉素SV生物合成的调节作用

本文报道了芳香化合物对力复霉素生物合成和芳香途径开始的DAHP合成酶活力的调节作用。首先,洗涤菌体实验结果指出,色氨酸对力复霉素sV合成有明显抑制,苯丙氨酸和酪氨酸本身作用不明显。其次,酶活力测定结果表明,色氨酸抑制力复霉素生物合成是由于它对DAHP合成酶的反馈抑制;同时,在无细胞抽出液中酪氨酸和苯丙氨酸对色氨酸抑制也显示了协同作用。此外,力复霉素芳香前体(C7N)的结构类似物对氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对抗生素合成也有影响,主要影响c,N的生物合成。     

莱阳茌梨细胞中多酚氧化酶的分布及其性质（简报）

莱阳茌梨果实细胞中,多酚氧化酶活性有80％分布于细胞溶质部分,11％分布于线粒体中,约6％存在于更小的亚细胞颗粒中。该酶只催化邻二元酚的氧化,对一元酚及间、对二元酚不起催化作用。邻—香豆酸为该酶的非竞争性抑制剂,Ki为 0.36mmol/L。苯甲酸为该酶的竞争性抑制剂,Ki为0.27 mmol/L。     

代谢途径抑制剂及前体对海洋红树林内生真菌No.1403产抗肿瘤化合物1403C的影响

采用酶抑制剂法和前体喂养试验法初步研究了结构新颖的活性蒽醌化合物1403C的合成途径.研究表明,甲羟戊酸合成途径的关键酶抑制剂邻氨基苯甲酸、柠檬酸三钠对单位菌体1403C产量影响比较小;莽草酸途径关键酶氨基苯甲酸合成酶的抑制剂三甲胺在低浓度时(3、6 mmol/L)对单位菌体1403C产量没有影响,而高浓度(12 mmol/L)时由于较大程度改变发酵液pH而降低了单位菌体1403C产量;莽草酸途径中间产物莽草酸的添加对单位菌体1403C产量没有明显的影响;添加聚酮合成途径聚酮合酶的专一性抑制剂碘乙酰胺对1403C的合成产生强烈的抑制,抑制程度达94.2%;添加丙二酸对1403C的合成有较大的促进作用,单位菌体1403C产量最大增加了59.2%.乙酸钠和丙二酸混合比例为1∶ 4时对单位菌体1403C产量具有最大促进作用,最大提高量为102.7%.由此推断Halorosellinia sp.(No.1403)可能通过聚酮途径合成1403C.     

发酵液中 L-色氨酸的提取

L-色氨酸为必需氨基酸之一,在人体代谢有着重要的功用,是配制复合结晶氨基酸注射液的基本原料,其价格昂贵,国内尚供不应求。至今,除用化学合成生产色氨酸外,利用微生物发酵法生产 L-色氨酸已越来越受到人们的重视,国内外均有不少研究报告。根据中国科学院微生物研究所的研究报告,我们于1976年采用邻氨基苯甲酸为前体物发酵法,协作进行了 L-色氨酸的试制工作。当时,由于受到强烈地震的影响,试制工作未能园满结束,但在克服重重困难之后,仍然摸索了一     

大肠杆菌色氨酸转运系统多基因敲除对色氨酸生产的影响

大肠杆菌中色氨酸向胞内的转运主要是由mtr、tnaB和aroP 3个基因编码的通透酶进行调控.利用Red重组技术,在mtr单基因敲除菌的基础上,成功构建了mtr.tnaB和mtr.aroP双基因敲除菌以及mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌,并通过发酵实验首次考察了色氨酸转运系统多基因缺失对大肠杆菌合成色氨酸的影响.发酵结果表明,mtr.tnaB和mtr.aroP双基因缺失后,色氨酸产量分别达到1.38 g/L和1.27 g/L,与出发菌株相比分别提高了17％和9％,而mtr.tnaB.aroP三基因缺失后,菌体生长受到了明显抑制,发酵后色氨酸产量仅为0.63 g/L.在补料分批发酵实验中,mtr.tnaB双基因敲除菌的色氨酸产量进一步提高至12.2 g/L,与出发菌株相比色氨酸产量提高了27％.     

N、β萘磺酰—DL—色氨酸制备方法的改进

本文采用相转移催化技术,改进了制备方法,提高了产率。添补了N、β—萘磺酰—L—色氨酸,N、β—萘磺酰—DL—色氨酸的红外谱图。测定旋光度,校核该化合物的熔点。     

大肠杆菌邻氨基苯甲酸合成酶编码基因trpED的克隆与表达

目的:通过基因重组的方法获得在体外具有邻氨基苯甲酸合成酶活性的基因trpED,为进一步解除反馈抑制的基因改造寻找靶标。方法:分别构建重组质粒pBV220-trpE和pBV220-trpD;由于trpE和trpD存在翻译偶联现象,将其自大肠杆菌基因组中经PCR扩增得到,构建新的表达质粒pBV220-trpED。结果:SDS-PAGE显示,包含质粒pBV220-trpED的重组菌在相对分子质量约53000(trpE基因表达)和56000(trpD基因表达)处的蛋白表达量明显增多,且邻氨基苯甲酸合成酶活性是对照的3倍。结论:翻译偶联的存在直接影响蛋白活性的发挥;重组质粒pBV220-trpED的获得为进一步的基因改造,以提高色氨酸产量奠定了研究基础。     

纤维素酶水解糠醛渣生产酵母II．糠醛渣酶解液培养酵母

从82株不同种属酵母中选得3株酵母,它们能较好地利用纤维素酶水解糠醛渣所产生的糖液。其菌名和编号是假丝酵母(Candida sp.)As 2．121,热带假丝酵母(Candida tropicalis)培养基糖浓度以1．5％或2．0%较好,这与原始酶解液的糖浓度及其中糠醛等有毒物质有关。最好将原始酶解液稀释一倍以上使用。另外补加相当于含糖量7．5％的(NH4),SO4,5％的KH2PO4和2．5％的尿素。起始pH以5较好。三株菌的最适生长温度略有差异, AS2.121为28—32℃,AS 2.637为2 8—37℃,AS 2.1180为30—35℃,但最适生长温度范围均较广,在 生产上较易控制。在250毫升三角瓶中装培养基50毫升,接种酵母后在旋转摇床(170转／AS 2.121 菌株之菌体产率高且稳定,常达50％;AS 2．637菌株较耐高温,菌体产率亦可高达50％左右;AS 2．1180菌株在摇瓶培养条件下菌体产率较低,为40—45％,且较不稳定,可能和培养基pH值的控制有关。     

利用氯霉素副产品物邻硝基乙苯合成L—色氨酸

<正> L—色氨酸是人体必须的八种氨基酸之一,主要用于制造复方氨基酸输液,同时在医疗、食品和饲料等方面的应用也日益广泛,在经济上具有广阔的发展前景。本厂在氯霉素生产的硝化过程中伴有大量邻硝基乙苯生成,长期以来,这些副产品由于得不到合理利用,不仅使大量社会财富白白浪费,且给工厂的环保和安全构成了严重的威胁。因此,利用这些副产物合成社会需求的产品L—色氨酸是一项一举两得、经济效益十分显著的课题。     

化学-酶法制备L-高苯丙氨酸

以苯丙酸乙酯为原料,通过正交设计优化2-氧4-苯基丁酸盐的制备条件：苯丙酸乙酯与草酸二乙酯摩尔比为1：3,缩合反应时间为2．5h,H2SO4质量分数为20％,水解反应时间为15h,优化条件下2-氧-4-苯基丁酸盐的产率为68．24％。随后,利用E．coli A5所产的天冬氨酸转氨酶为生物催化剂制备L-高笨丙氨酸。酶转化反应的最适条件为：游离细胞体系pH、温度、底物质量浓度和细胞质量浓度分别为8．5、37℃、20g/L和30g／L;而固定化细胞体系则分别为7．0—9．0、40℃、10g／L和30g/L。采用廉价的L-谷氨酸（L—Glu）作为氨基供体,添加表面活性剂有利于提高L-HPA产率。通过研究固定化细胞转化反应进程,结果发现8h内90％的底物可转化为L—HPA。     

刺孢小克银汉霉菌体氨基酰化酶的性质研究

首次选育出有较高氨基酰化酶活性的菌株刺孢小克银汉霉（Cunninghamella echinulata）9980,并进行液体培养,比较了3种不同培养基中菌体细胞氨基酰化酶活性,考察了几种因素对菌体细胞酶活的影响。结果表明：蛋白胨培养基中菌体细胞酶活最高,达680u／g。菌体细胞酶活最适温度55％,最适pH7．0,最佳底物浓度为0．2mol／L,缓冲液中的无机离子对酶活有抑制作用,10^-3-10^-4mol／L的Co^2＋对酶活有激活作用。