大肠杆菌poly(A)化mRNA基因的芯片制备

利用大肠杆菌mRNA中存在的一定程度的poly(A)现象,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,纯化并逆转录mRNA,并应用RD-PCR双方法获得了170多条大肠杆菌poly(A)化mRNA的基因片段,利用这些片段打印成基因芯片,以供后续大肠杆菌的基因表达研究。     

蛋白质多肽文库构建中限制性显示技术的接头设计

为了探讨限制性显示(RD)技术在构建蛋白质多肽文库中灵活的接头设计,分别根据原核表达载体pET22b以及酵母表达载体pNMT-TOPO设计了三套接头,三套接头依次增加一个碱基以保证与之连接的片段总有可能表达正确的开放阅读框.然后以HIV-1 B亚型代表株U26942全基因质粒DNA为对象,利用RD技术分别建立了相应的蛋白质多肽文库.从每个库中各随机挑选12个克隆进行测序分析并进行蛋白质表达预测.结果从原核表达文库中获得了一个可以表达HIV Pol多肽的克隆,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示该克隆在细菌BL21(DE3)中有较高的表达,蛋白质印迹为阳性,与理论预测相符.这些结果提示,RD技术是一种建立基因组随机多肽文库的新方法,该方法灵活的接头设计可以满足不同的表达载体需求.     

Gateway(R)技术构建交链孢菌JH505 cDNA文库

Gateway○R技术构建cDNA文库,利用λ噬菌体的位点特异性重组,避免使用限制性内酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。首次应用Gateway○R技术构建交链孢菌cDNA文库,经检测cDNA入门文库的滴度达到1×107cfumL,文库总容量为9×107cfu,平均插入片段为1510bp。通过LR重组把入门文库转换为表达文库,表达文库的滴度为1.58×106cfu/mL,文库总容量为6.32×106cfu,平均插入片段大小为1680bp。表达文库的构建为进一步克隆植物激活蛋白基因打下了基础。     

分子生物学技术讲座（三）——真核细胞mRNA的提取,纯化,分析及cDNA文库的构建

哺乳动物平均每个细胞含有10-5μgRNA,理论上认为每克细胞可分离出5～10mgRNA。其中rRNA为80％～85％,tRNA占10％～16％,而mRNA仅占1％～5％,并且rnRNA分子种类繁多,分子量大小不均一,但绝大多数mRNA分子均在3’端存在ZO～250个多聚腺着酸P0ly（A）,所以利用其此特性,用寡聚（dT）亲和层析柱,很容易从总的RNA中纯化mR－NA分子。mRNA的分析通常采用甲醛变性胶电泳法和其它变性胶电泳法进行,或进一步用Northern印迹法和放射性探针杂交反应进行分析。N0rthern印迹法是指将RNA变性电泳后,转移至固相支持物上的过程。…     

棉花洞A雄性不育系花药发育的mRNA差别显示

应用cDNA-AFLP(Amplified fragment length polymorphism）技术,分析了棉花洞A雄性不育和可育材料在花药发育过程中花粉发育相关基因表达的差异。结果表明：在花药发育的相同时期,不育和可育花粉cDNA-AFLP的谱带在单核期的差异大于减数分裂期。在花粉发育过程中,花粉发育相关基因的表达具有时空特异性。共回收了64条差异cDNA片段,随机选择3个片段标记为探针,RNA斑点杂交分析表明,GHA27具有花器官组织特异性,仅在花器官中表达;GHA28、GHA47则具有花药组织特异性且仅在可育花药中表达。序列相关性比较表明：GHA27与植物ADP-ribosylation factor(ARF）基因有较高的相似性,而GHA28、GHA47与已知序列的相似性很低。     

基因组细菌人工染色体文库(BAC)的构建及应用

细菌人工染色体 (BAC)是一种承载DNA大片段的克隆载体系统 ,用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点。BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组学研究的重要基础 ,可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析。本文主要综述了细菌人工染色体的构建与其鉴定 ,及其在物理图谱构建、图位克隆、转基因技术等研究上的应用。     

cDNA(EST)文库的高通量生物信息学分析体系的构建与应用

应用生物信息学方法,构建了一套针对cDNA或EST文库的高通量、自动化分析体系,CLASP(cDNA Library Analysis SystemPrimary)。CLASP基于Linux操作系统,主要由Perl程序构成。它以cDNA文库(ESTs)序列为分析对象,具有自动查找序列同源基因并进行染色体定位(包括细胞遗传学定位和SIS定位)、EST自动延伸等功能;并对不同来源序列进行聚类分析。应用该体系对3对肺癌相关抑制性消减杂交(SSH)cDNA文库进行了分析。结果在所有3对文库的2083条EST中有1492条找到了同源基因,其中1365条得到染色体定位。对所余591条未知基因的EST进行了电子延伸,其中有214条EST得到不同程度的延伸。对上述cDNA文库中已知基因的EST以及电子延伸后的EST再分别进行聚类分析,而后综合两个聚类分析的结果,由此可发现不同文库间的共同与差异表达基因,可用于特定性状相关的基因功能预测。     

用差异显示PCR技术克隆冬小麦春化设定cDNA克隆实验系统的建立

差异显示PCR技术是一种新近发展起来的在真核细胞中检测与克隆特异表达基因的手段。本文建立了用此技术克隆春化相关基因的研究系统,并提供了诸如总RNA的提取、污染DNA的去除、sscDNA的逆转录、PCR参数、扩增cDNA的电泳、特异cDNA的收集与重扩增等在方法上的细节。用这种技术分离了一个仅在春化20天这一特异时期表达的春化设定cDNA克隆VPC28。这些结果也适用于更加广泛的类似研究。     

破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库的构建和功能基因筛选模型的初步建立

番茄果实的成熟是由多基因精细调控的一个过程．利用破色期番茄果实,根据复性动力学原理在mRNA水平进行均一化操作使高丰度和低丰度的mRNA丰度接近．然后把均一化之后mRNA反转录得到cDNA,再与基因沉默载体pTRV重组,最后把构建好的载体通过电转化的方法转入到GV3101农杆菌中,从而建立起破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库．通过番茄果实中病毒诱导基因沉默技术,对cDNA沉默文库进行初步筛选,从而确定功能基因筛选模型．在模型建立阶段,以番茄红素合成途径相关的PDS基因作为内标基因,在100个混合农杆菌样中,成功筛选到了PDS基因．     

A novel method for constructing pathogen-regulated small RNA cDNA library

Pathogen-responsive endogenous small non-coding RNAs regulate gene expression in relation to plant immune responses by serving as RNA silencing machinery. Decay caused by the bacterium, Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), often leads to soft rot disease in the plant Brassica campestris L. ssp. pekinensis (Bcp). To discover endogenous small RNA species in Bcp in response to Ecc infection, we developed a highly efficient approach for cloning pathogen-regulated small RNAs. A group of degenerate stem-loop reverse primers was designed to synthesize first single-stranded cDNA (sscDNA) and the sscDNA was then tailed with a poly(C) at its 3′ end to create a forward priming site. A novel cDNA/RNA subtractive hybridization was performed to capture Ecc-regulated small RNAs and this subsequently allowed construction of small RNA cDNA libraries for sequencing.     

淫羊藿嫩叶cDNA文库的构建

以淫羊藿嫩叶为实验材料,用Trizol方法提取植物总RNA,纯化出mRNA,用SMART(the Switch Mechanism At the5′end of RNA Templates)技术反转录成cDNA,同时使用CHROMA SPIN-400凝胶柱层析纯化cDNA,最后将片断连入λTriplEx2 vector,经包装得到500μL原始文库,文库的滴度为1.2×106Pfu/mL。经体内切割后,随机挑选文库的20个阳性克隆进行PCR鉴定,算出文库的重组率为80%,扩增出的片断主要集中在0.5~2kb之间。结果说明文库质量较好,可以用于基因筛选。     

草豆蔻cDNA文库的构建及鉴定

以草豆蔻花序原基为材料,构建了cDNA文库。原始文库滴度为0.8×106pfu/mL,扩增后滴度为4.23×1011pfu/mL。插入片段大小在500bp～1.5kb之间,重组率为95.3%。以水稻RAP1A基因中包含MADS-box保守区段的序列为探针对该文库进行筛选,获得的阳性克隆经测序及序列比对分析,确认其中共有10个含MADS-box的阳性克隆。     

A novel method for constructing murine cDNA library enriched with maternal mRNAs exhibiting de novo independent post-fertilization polyadenylation

Recently, mouse maternal mRNAs such as SSEC-D, Spin, beta-catenin, Ptp4a1, and Maid have been found to exhibit de novo independent polyadenylation after fertilization. To obtain an overall picture of post-fertilization polyadenylation events, we developed a novel method for constructing murine fertilized egg cDNA library enriched with cDNAs exhibiting de novo independent polyadenylation. As a pilot study, we isolated at least four new maternal mRNAs exhibiting extension of poly(A) tail in fertilized 1-cell eggs. Moreover, various types of polyadenylation of maternal RNAs were observed at this stage, suggesting the presence of novel mechanisms for regulating the length of poly(A) tails of maternal mRNA. This is the first report of successful construction of a cDNA library enriched with newly polyadenylated maternal mRNAs derived from post-fertilized mouse eggs. This cDNA library will be useful for molecular analysis of the mechanisms underlying post-fertilization polyadenylation of mammalian maternal RNAs.     

用限制性cDNA文库制作K562细胞基因表达谱芯片探针

以人红白血病K562细胞为材料,应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建cDNA文库,该文库通过PCR引物3′端延伸两个不同碱基形成136对引物对cDNA进行限制性扩增,得到136组不同的PCR扩增产物,纯化后与载体连接并转化细菌,即为限制性cDNA文库,根据不同的分组进行克隆的鉴定和分离。并进行大量扩增制备cDNA芯片探针,该方法构建的文库因经过了限制性分组扩增,每组均含有特定的cDNA,因而大大加快了随后克隆的分离 和鉴定的速度,为基因芯片探针制备提供了一个新方法。     

灰飞虱高带毒（RSV）群体酵母双杂交cDNA文库的构建

为了研究灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén与水稻条纹病毒（rice stripe virus, RSV）互作机制, 本研究构建了灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库。以实验室筛选的灰飞虱高带毒群体为材料, 分离纯化mRNA, 反转录合成双链cDNA, 并连接三框型接头, 层析柱分级纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库, 再通过同源重组将入门文库转移到Gateway兼容载体pGADT7-DEST上, 构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明： 文库库容量为3.68×10⁷ cfu, 扩增文库滴度为2.62×10¹⁰ cfu/mL; 文库重组率大于95%, cDNA插入片段平均长度>1 kb, 达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。     

Screening of substrate peptide sequences for tissue-type transglutaminase (TGase 2) using T7 phage cDNA library

Transglutaminase (TGase) is a family of enzymes that catalyzes cross-linking reaction between glutamine- and lysine residue of substrate proteins in several mammalian biological events. Substrate proteins for TGase and their physiological relevance have been still in research, continuously expanding. In this study, we have established a novel screening system that enables identification of cDNA sequence encoding favorable primary structure as a substrate for tissue-type transglutaminase (TGase 2), a multifunctional and ubiquitously expressing isozyme. By the screening, we identified several T7 phage clones that displayed substrate peptides for TGase 2 as a translated product from human brain cDNA library. Among the selected clones, the C-terminal region of IKAP, IkappaB kinase complex associated protein, appeared as a highly reactive substrate sequence for TGase 2. This system will open possibility of rapid identification of substrate sequences for transglutaminases at a genetic level.     

“电子”cDNA文库筛选指导基因的全长cDNA克隆

“电子”ｃＤＮＡ库筛选主要是指通过采用生物信息学的方法延伸表达序列标签（ＥＳＴ）序列,以获得基因的部分及至全长ｃＤＮＡ序列,避免或部分避免构建与筛选ｃＤＮＡ库等烦琐的实验室工作。该方法具体体现了ＥＳＴ数据库的迅速扩张已导致识别与克隆新基因的策略发生革命性的变化。ＥＳＴ序列ＺＡ７３为本实验室克隆到的可能参与辐射致气管上皮细胞恶性转化过程的基因片段,本研究采用“电子”ｃＤＮＡ库筛选的方法对其可能