重组DNA技术用于生产蛋白质

重组DNA技术正在许多方面有所应用,建成的“工程细菌” (或酵母)可生产非常有价值的蛋白质如胰岛素、干扰素、α-淀粉酶、凝乳酶(chymosin)(BNW.,1983,3(9):4)和疫苗等(见表),这些蛋白质在医、工、农方面得到应用。     

表位疫苗及相关技术研究进展

表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗,是近年来新兴的一种疫苗研制技术,也是今后最具开发前景的疫苗技术之一,在肿瘤、病毒等疾病的防治中有着自身独特的优势。本文详细阐述了T表位和B表位的筛选和鉴定方法、表位疫苗的载体研究及表位疫苗在肿瘤、病毒和微生物感染中的应用等,对表位疫苗的最新研究进展进行了综述。     

表位疫苗研究进展

表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗,是近年来新兴的一种疫苗研制技术,也是今后最具开发前景的疫苗技术之一,在肿瘤、病毒等疾病的防治中有着自身独特的优势.详细阐述了T表位和B表位的筛选和鉴定方法、表位疫苗的载体研究及表位疫苗在肿瘤、病毒和微生物感染中的应用等,对表位疫苗的最新研究进展进行了综述.     

口蹄疫新型疫苗及其免疫特性研究进展

口蹄疫是世界性重大动物疫病,接种疫苗是预防该病的重要策略之一。随着现代分子生物学技术的发展,对一些新型口蹄疫疫苗如亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、可饲疫苗、多表位疫苗等的研究和探索已全面展开。我们简要介绍了近年涌现的口蹄疫新型疫苗,以为口蹄疫分子疫苗的设计提供参考。     

国外科技简讯

利用植物生产疫苗 据 AgBiotech News and In-formation 1995年3月报道:美国加利福尼亚州生物资源技术公司和美国马里兰州海军医学研究所的科学家构建了重组烟草花叶病毒(TMV)表面上的疟疾表位(抗原决定簇)。他们通过生物工程把疟疾序列表达于TMV衣壳蛋白。选择B细胞疟疾表位或是被插入 TMV衣壳蛋白的环区,或是被融合于其C末端。用上述任何一种形式的修饰病毒感染烟草植株,都可产生大量的衣壳蛋白。重组植物病毒有可能满足亚单位疫苗生产的需要。这种植物疫苗不仅生产成本低廉,而且可在室温下贮存。一个植株所生     

保护HLA—DR3转基因鼠抗结核杆菌感染的复合期多表位疫苗

结核分枝杆菌（Mtb）每年导致近200万人死亡。BCG是当前唯一使用的结核病疫苗,能够诱导不恒定的保护力,不能防止潜伏性结核病的复活。因此,急切需要有效的疫苗来补充BCG。由于在细菌的繁殖阶段与休眠阶段结核分枝杆菌的蛋白质组在性质和数量上不同,所以改良的结核病疫苗应该能够诱导产生对感染各个阶段表达的结核分枝杆菌抗原的免疫应答。因此,这种“复合期”疫苗应该由结核分枝杆菌感染不同阶段表达的（免疫决定簇）抗原组成。作为一个概念性多级疫苗,我们通过融合五种HLA—DR3限制性T细胞表位构建了一个多表位肽（polyepitope）,这些限制性表位来源于不同的结核分枝杆菌蛋白,有繁殖期高表达产物（Ag85B,hsp65,19kDa脂蛋白）,有休眠菌富表达而且经结核菌素皮下测试阳性（TST＋）个体验证的产物（hspl6,Rvl733c）。在体外试验中,结核病治愈后HIA-DR3＋而非HLA-DR3-病人和结核菌素皮下测试阳性个体的外周血单核细胞对复合期多表位肽反应良好。使用缺乏内源性鼠Ⅱ类基因的HIA—DR3转基因小鼠模型,在体内分析了复合期多表位肽的免疫原性和保护效力。用CpG做佐剂的复合期多表位肽免疫动物产生了高水平的IgG以及多功能CD4’T细胞,它们能够产生HLA-DR3限制性表位特异性的IFN-y、TNF和IL-2。重要的是,当作为预防性疫苗时用结核菌攻击之后,复合期多表位肽的免疫降低了肺部结核杆菌的数量。考虑到可用于免疫识别的潜在Mtb抗原的广谱性,我们的模型数据证明了复合期多表位肽疫苗预防结核病的潜力。     

抗原类似物对HIV有作用

国立过敏和传染病研究所(NIAID：Bethesda,马里兰州)的研究者找到了一种新途径,将有可能研制出具有广谱作用的HIV疫苗。在所长Pmtbony Fatlci和Giusppe Scala的领导下,研究组鉴定了对应于各型HIV的表位因子,并根据HIV被膜蛋白创制出了一种疫苗,能够广泛保护猴子免受SHIV(猿一人免疫缺损病毒)的侵染。     

生物信息学方法预测病原体抗原蛋白序列中多肽疫苗候选表位

根据病原体抗原基因中具有免疫原性的表位氨基酸序列,通过化学合成技术可制备该病原体的多肽疫苗.相较于灭活和减毒疫苗,多肽疫苗因成分简单、特异性强、安全性高、易于保存等优点成为疫苗研发的重点.然而,特异有效的疫苗候选表位的预测和筛选,仍是限制多肽疫苗设计与研发的一个重要因素.本研究综合多个生物信息学工具,构建了一个可用于预...     

应用噬菌体展示技术筛选人巨细胞病毒糖蛋白M新的中和抗原表位

人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白复合物Ⅱ包括两种蛋白,即糖蛋白M(gM)和糖蛋白N(gN)．尽管来自于HCMV阳性病人血清中的糖蛋白复合物Ⅱ的IgG抗体能够中和HCMV粒子,但迄今为止,还没有gM中和性抗原表位的相关研究．应用消减杂交技术,通过噬菌体肽库筛选获得gM抗原的一个表位,即MAD．MAD氨基酸序列与gM第32～38位序列高度同源．将MAD与钥孔血蓝蛋白偶联免疫小鼠可产生抗MAD多抗,该多抗不仅结合天然HCMV病毒粒子,而且特异结合重组表达的gM30～78多肽．ELISA结果表明MAD能够特异结合HCMV阳性的病人血清．病毒中和实验结果进一步证明抗MAD多抗能够抑制HCMV AD169株病毒感染人胚肺细胞．总之,MAD表位有可能成为HCMV病毒疫苗潜在的保护性抗原.     

应用ELISPOT方法筛选确定HIV-1B'/C亚型疫苗六种抗原的H-2d限制的T细胞表位

为了筛选和确定用于检测表达HIV-1 B’/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、polr、evt、at和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位,本研究使用表达上述6种抗原的复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过矩阵设计将HIV-1 B(C)亚型6种相应抗原全序列肽库分别混合成肽池,使用肽池对免疫小鼠进行IFN-γELISPOT检测,根据检测结果确定肽库中特异反应的优势表位肽。结果显示:筛选到七条针对Gag的特异表位肽,其中有5条与文献报道相同,另2条为新表位肽;筛选到3条针对Pol蛋白特异表位肽,其中一条为新表位肽;筛选到2条针对gp160特异表位肽,其中一条为新表位肽;在Nef肽库中筛选到一条新的表位肽;从Tat肽库中筛选到3条表位肽,这三条肽在肽库中是连续的序列,都包含(或部分包含)网上公布的表位序列;在Rev肽库中没有筛选到能够产生阳性反应的特异性表位肽。本研究使用IFN-γELISPOT方法筛选和确定了可用于检测表达HIV-1 B’/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、pol、revt、at和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位。     

新型Aβ42寡聚体模拟表位疫苗的制备

旨在获得一株特异靶向致病性Aβ42寡聚体的模拟表位疫苗。在前期工作中,应用亲和层析的方法从人静脉用免疫球蛋白(Intravenous immune globulin,IVIG)中纯化获得特异性识别Aβ42寡聚体的抗体组分IVIG-AOB。以IVIG-AOB为靶蛋白,应用噬菌体展示技术淘选出一系列Aβ42寡聚体的特异性环状模拟表位多肽,随后将表位多肽融合表达至乙肝病毒核心蛋白(HBcVLP)构建成表位载体疫苗,进而将免疫小鼠,从中筛选出能有效免疫产生抗Aβ42寡聚体抗体的模拟表位疫苗。从噬菌体环形七肽库中筛选出5条特异性结合IVIG-AOB的模拟表位多肽,将其克隆至HBc载体,并在大肠杆菌中成功表达和组装成嵌合表位的HBc-VLP,通过免疫小鼠优选出一株效果最好的Aβ42寡聚体构象表位疫苗HBc-C4。Aβ寡聚体是AD发生发展的主要致病因素。基于Aβ42寡聚体独特的构象表位研制的表位HBc-VLP疫苗诱导机体产生的抗体将能够特异靶向并中和毒性Aβ42寡聚体,而不影响Aβ42的正常生理功能,从而起到从根本上治疗AD的作用。     

Asia I型口蹄疫病毒中和表位与羊IgG重链恒定区的融合表达及免疫原性测定

VP1蛋白是口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)诱导机体产生抗病毒感染免疫的主要蛋白,含有病毒的若干中和表位。本研究设计和合成了由AsiaI型FMDVVP1蛋白136~160aa和198~211aa两个表位组成的重复串联表位的编码基因,并克隆了羊IgG重链恒定区编码基因。利用BamHI、EcoRI和XhoI位点将2个基因片段依次克隆到pPROExHTb载体,构建成重组质粒pPRO-FshIgG,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达得到融合蛋白FshIgG。100μgFshIgG蛋白免疫豚鼠后刺激豚鼠产生了高效价的FMDV中和抗体,而且使这些免疫豚鼠在用200ID50剂量FMDV攻击时得到了完全保护。由此证明,羊IgG重链恒定区蛋白能够作为FMDV表位肽的载体,而融合蛋白FshIgG可成为一种口蹄疫表位疫苗候选物用于口蹄疫的预防。     

GM-CSF和IL-4增强Aβ表位DNA疫苗的免疫原性研究

目的:探究和评价粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)作为β淀粉样蛋白(Aβ)表位DNA疫苗的分子佐剂,增强DNA疫苗体液和细胞免疫反应的水平。方法:阿尔茨海默病DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T分别与重组DNA分子佐剂p VAX1-S-IL-4和p VAX1-S-GM-CSF联合免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。结果:分子佐剂IL-4组相比单独的DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T组抗体水平具有一定程度的提高;GM-CSF能明显提高DNA疫苗Aβ特异的抗体水平和泛DR辅助T细胞表位(PADRE)特异的细胞免疫反应,4次免疫后其抗体滴度提高了4倍。结论:GM-CSF佐剂能够有效地用于今后阿尔茨海默病DNA表位疫苗的研究中。     

乙型肝炎多表位DNA疫苗的发展趋势

乙型肝炎多表位DNA疫苗(epitopeDNAvaccine,minigenes/epigenes)是指多个表位(包括T细胞、B细胞等表位)经过优化组合,以能产生高效的细胞、体液免疫应答进而清除HBV病毒为目的而得到的新型乙肝疫苗。该文介绍近年来国内外在乙型肝炎多表位DNA疫苗方面的发展趋势。     

弓形虫新基因wx2表位疫苗免疫小鼠的保护研究

采用牛物信息学方法对弓形虫新基因wx2进行表位分析预测,PCR扩增基因中编码2个表位的片段w2b和w2a,成功构建新基因的单表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a和双表位疫苗pcDNA3-w2b2a,接种小鼠,观察表位疫苗的免疫保护作用.将表位疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3空质粒.ELJSA法检测血清IgG抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群.各组小鼠末次免疫后第4周每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察小鼠的生存时间.结果显示,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P＜0.05),且pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠脾细胞CD4 T与CD8 T淋巴细胞比值明显低于两单表位疫苗组,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠存活时间明显长于两单表位疫苗组(P＜0.05).实验结果表明,弓形虫新基因wz2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,并且弓形虫poDNA3-W2b2a双表位疫苗的免疫保护性优于pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a两单表位疫苗.     

新一代疫苗——短肽疫苗的研究

短肽疫苗是在分子免疫学发展的基础上提出的,ＭＨＣ分子结合Ｔ、Ｂ细胞的表位后呈递给淋巴细胞,从而激活免疫系统。短肽疫苗通过模拟Ｔ、Ｂ细胞的表位,与ＭＨＣ分子结合,激活细胞和体液免疫,达到预防和治疗的目的,而疫苗制备的关键问题在于表位的筛选及佐剂的使用,本文就这些方面的问题进行了综述     

恶性疟原虫CTL抗原微表位基因重组疫苗的构建和免疫原性预测

选用中国人群常见的MHCⅠ类分子HLA-A2.1和HLA-B51限制性恶性疟CTL抗原表位, 构建了单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh,再将上述表位DNA序列串联,构建成双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts.将3种重组疫苗分别转染C1R/HLA-A2.1和K562/HLA-B51细胞后均证实表达.单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh的表达分别促进细胞表面HLA-A2.1和HLA-B51的稳定性.免疫共沉淀实验证实上述表位促进细胞表面HLAⅠ类分子组装,并提示特异性表位在细胞表面的递呈.双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts在以上两个不同细胞系中的表达与两个单表位微型基因的表达结果相似,证明双表位肽的串联编码构型不影响肽链中不同表位的特异性抗原递呈.这一研究结果为进一步设计具有广泛覆盖率的多表位恶性疟重组CTL疫苗提供了理论和实验基础.与常规体外CTL实验不同,本研究观察微表位基因在表达特定MHCⅠ类分子的人细胞中进行内源性抗原递呈的过程,其方法更接近人体内环境,对于人类CTL抗原表位的确定和人重组CTL表位疫苗免疫原性的预测具有重要意义.     

表位疫苗的设计及应用研究进展

表位疫苗相对传统疫苗拥有较多优势,其最大的优点就是可以克服传统疫苗造成的毒力恢复或散毒的可能。另外表位疫苗本身无毒、稳定,符合未来疫苗发展的方向。表位疫苗的设计需要从表位的筛选、优化及表位的组合等多方面展开。现对表位疫苗的设计策略及应用作一介绍。     

幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究 *

目的 利用生物信息学软件评价幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)多价表位疫苗CWAE的抗原结构,经原核表达获得高纯度CWAE蛋白,进而鉴定多价表位疫苗CWAE的免疫学性质。方法 通过生物信息学软件分析H. pylori多价表位疫苗CWAE的抗原结构;用人工合成的H. pylori多价表位肽融合基因WAE替换重组质粒pET28a-CUE中的UE基因,构建重组质粒pET28a-CWAE。然后,将pET28a-CWAE转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化抗原蛋白CWAE;利用GM1-ELISA鉴定CWAE中CTB组分的黏膜免疫佐剂活性。最后,通过ELISA和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测CWAE激发BALB/c小鼠产生抗H. pylori抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的能力。结果 通过生物信息学软件证实H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的结构;重组表达质粒pET28a-CWAE经PCR、双酶切和基因测序鉴定,融合基因CWAE与设计序列完全一致;重组基因工程菌株pET28a-CWAE/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,抗原蛋白CWAE主要以包涵体形式存在,经Ni-NTP镍离子亲和层析纯化,纯度约达93.2%;GM1-ELISA实验证实,CWAE中CTB组分依旧保持有较好的黏膜佐剂活性;ELISA结果证实CWAE能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体,而小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验进一步证实CWAE能够激发针对H. pylori多种致病因子的淋巴细胞免疫反应。结论 H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构,经原核表达可获得高纯度抗原蛋白,能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答。为研发防治H. pylori感染的多价表位疫苗奠定实验基础。     

细菌表面展示技术的应用研究进展

细菌表面展示系统是微生物表面展示系统的一个重要分支。由于呈现载体灵活多样,可根据不同的需要呈现蛋白或多肽等特点,细菌表面展示技术近年来得到了迅猛发展,在重组细菌疫苗、抗原表位分析、全细胞催化剂、全细胞吸附剂、多肽库筛选等多个领域得到广泛应用。本文就细菌表面展示技术的应用研究作一综述。