猪水泡病病毒VPl基因抗原区的原核表达

利用RT-PCR和nested PCR(nPCR)技术扩增出猪水泡病病毒VPl基因的抗原区,将其克隆到表达载体pProEX-HTb中,获得重组质粒,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确。将重组质粒导入BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测表明,重组菌能表达猪水泡病病毒VPl抗原区蛋白;Western blot检测表明,诱导表达的抗原区蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDVVP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Westernblotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDV VP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析.然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体.经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原.SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%.Western blotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应.融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础.     

猪水泡病病毒VP2基因抗原区在大肠杆菌中的表达

利用RT_PCR技术 ,以SVDVHK’70为材料 ,扩增出VP2基因抗原区。将目的基因的PCR扩增产物直接进行双酶切 ,然后将酶切产物与酶切后的表达载体pGEX 4T_1进行连接 ,转化BL2 1菌体并提质粒 ,经酶切、PCR鉴定为阳性的重组质粒命名为pGEX_VP2 ,并测序。测序结果表明 ,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确 ,表达载体构建成功。将含有阳性质粒的BL2 1菌液经IPTG诱导后进行SDS_PAGE分析 ,出现预期的目的蛋白条带 ,此目的蛋白经Westernblot检测确定其有免疫活性。     

猪水泡病病毒强致病性毒株主要保护性抗原蛋白基因cDNA的序列测定 …

从猪水泡病病毒细胞培养物的ＰＥＧ浓缩毒中提取病毒ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ和套式ＰＣＲ扩增病毒主要保护性抗原蛋白基因,将扩增产生１．６ｋｂ插入ｐＵＣ１８载体中,经亚克隆后用双脱氧链终止法测定其序列,与已发表的ＳＶＤＶ分离物该区序列作比较。     

非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段（vp73l）。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21（DE3）,经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coli BL2（DE3）高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。     

猪水泡病病毒强致病性毒株主要保护性抗原蛋白基因cDNA的序列测定与分析

从猪水泡病病毒（ＳＶＤＶ）细胞培养物的ＰＥＧ浓缩毒中提取病毒ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ和套式ＰＣＲ扩增病毒主要保护性抗原蛋白基因,将扩增产物１．６ｋｂ插入ｐＵＣ１８载体中,经亚克隆后用双脱氧链终止法测定其序列,与已发表的ＳＶＤＶ分离物该区序列作比较,核苷酸同源性为９６％－９７％,氨基酸同源性为９８％,参与构成ＳＶＤＶ中和性抗原位点的几个氨基酸残基均很保守;与已发表的柯萨奇Ｂ５病毒的对应序列比较,两者核苷酸序列同源性为７７％,而推导的氨基酸顺序同源性竞高达９２％。本文结果有助于ＳＶＤＶ的分子流行病学研究,并为其和柯萨奇Ｂ５病毒的相互关系提供参考数据,为ＳＶＤＶ新型疫苗研究提供了基础材料     

猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达

目的：用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法：通过对GenBank发表的猪细小病毒（Porcine Par-vovirus,PPV）中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩增出包含NS1主要抗原表位区的843bp的片段。酶切后连接到原核表达载体pET30a（＋）上,构建的原核表达载体pET30a-NS1s转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达。结果：重组蛋白大小约为43kD,与预期大小相符。Westernblot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。结论：NS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。     

猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立

分别建立基于猪嵴病毒(PKV)结构蛋白VP0与VP1的间接ELISA检测方法。对PKV结构蛋白VP0与VP1的基因进行合成并连接至原核表达载体pET-32a后,转入感受态细胞BL21中,用IPTG诱导表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,分别以重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1作为包被抗原,采用棋盘滴定法建立两种间接ELISA检测方法,并进行重复性、敏感性、特异性实验和临床检测。结果显示重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1抗原的最佳包被浓度分别为2 mg/mL和2.5 mg/mL,反应条件均为37℃、1 h;封闭液最佳条件为5%脱脂乳,37℃、2 h;血清最佳孵育条件为1∶200,37℃、1 h;二抗最佳孵育条件分别为1∶20 000和1∶15 000,37℃、1 h;最佳显色时间为10 min,两种间接ELISA检测方法临界值分别为0.306和0.277。试验结果表明本研究成功建立了能够有效检测PKV血清特异性抗体的间接ELISA方法,且方法具有重复性好、敏感性高、特异性强、稳定性好等特点,对今后PKV的临床诊断及抗体检测试剂盒的开发奠定了重要基础。     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2Ⅰ蛋白主要抗原域VP2Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性标准初步定为OD490>0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1。     

Expression of enterovirus 70 capsid protein VP1 in Escherichia coli

The VP1 gene of enterovirus 70 (EV70) possesses a large number of Escherichia coli low-usage codons (11.0%) and a bacterial ribosome binding site complementary sequence (RBSCS) 5'-UGUCUCCUUUUC-3' flanking the codon 139. Plasmids containing EV70 cDNA encoding the full-length VP1 failed to express in E. coli (BL21(DE3), Rosetta 2(DE3) or Rosetta (DE3)pLysS). High expression (>8% of total protein) of recombinant VP1 (rVP1m) in E. coli required engineering of the encoding cDNA (conserved modification of the native cDNA) by simultaneous substitution of a rare-codon cluster located between codons 103 and 132, and replacement of the RBSCS-TCCTTT sequence. The rare-codon frequencies of the cDNAs encoding VP1 non-overlapping terminal fragments N138 (1-138 aa) and C170 (141-310 aa) are similar (10.9 and 11.2%, respectively). However, in E. coli, high expression of recombinant C170 (rC170) required no modification of the native cDNA whereas high expression of recombinant N138 (rN138m) required minimal synonymous substitution of the above rare-codon cluster. The rare-codon cluster of EV70 VP1 gene has five least-usage arginine codons (AGG/AGA) and three tandem rare-codon pairs (AGGAGG, CUAAGG, and AGACUA). Our results suggest that the rare-codon cluster (its rare codon arrangement per se and/or its related mRNA secondary structure(s)) and the RBSCS in EV70 VP1 gene, not the rare-codon frequency, constitute the key elements that suppress its expression in E. coli.     

铁蛋白与口蹄疫病毒VP1在大肠杆菌中融合表达及纳米颗粒自组装

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的世界上最重要的畜牧疾病之一,严重影响世界畜牧业的发展,而疫苗免疫仍然是对疫情预防和控制的最有效手段.铁蛋白具有自组装和生物修饰的特性,在纳米疫苗等领域具有广阔的应用前景.选用O型口蹄疫病毒的vp1基因和幽门螺杆菌铁蛋白基因,通过融合PCR将vp1基因构建到铁蛋白亚基基因前端,在大肠杆菌中表达后...     

酿酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大肠村菌中的表达

用PCR方法克隆了1．5kb的酿酒母Sacchromyces cerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI,将该片段连接到pUC19载体,通过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌Escherichia coli FF4169 和FF4050,对转化株的质粒DNA酶切分析表明均含有1．5kb PCR克隆片段,生长曲线实验证明,带有克隆片段的转化株在含0．5mol/L NaCl的高渗透压基础培养基中生长良好;用高效液相色谱（HPLC）结合蒸发散射（ELSD）技术测定细胞内海藻糖实验证明转化株能够合成海藻糖。     

口蹄疫病毒VP1基因转化马铃薯及其块茎专一性表达

报道了FMDV VP1基因与马铃薯块茎专一性表达class Ipatatin基因5′区融合,经农杆菌介导导入马铃薯植株,PCR、RT-PCR证实了其整合及转录表达。ELISA结果进一步表明,VP1在转基因马铃薯块茎中具有免疫活性。为探讨在马铃薯块茎中高表达VP1蛋白及进一步开发其作为FMDV口服疫苗生物反应器奠定基础。     

轮状病毒VP7基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性

轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体。VP7是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原,是发展基因工程疫苗的首选。把包含全部3个主要抗原性区域的轮状病毒SA11 VP7基因片段以谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,表达产物占菌体总蛋白的30%左右。经一步Glutathione Sepharose4B亲和纯化,重组蛋白纯度超过90%。Western blot实验表明,重组蛋白可被抗SA11的多抗特异地识别。动物实验表明,重组抗原可在小鼠和家兔体内诱导VP7特异的抗体和一定水平的SA11中和抗体。