仙台病毒黑龙江省地方株的分离与鉴定

目的自本省普通级实验动物中分离并鉴定出仙台病毒地方毒株,为建立仙台病毒血清抗体检测方法奠定基础。方法通过鸡胚尿囊腔传代自普通级小鼠肺脏分离病毒,经血凝实验、血凝阻断实验和结构基因序列测定对分离得到的病毒进行鉴定;大量繁殖病毒并通过蔗糖密度梯度离心纯化,免疫动物制备阳性血清,用标准试剂盒检测阳性血清效价。结果自150份小鼠肺脏分离到2株有血凝性的病毒,经形态学、血清学和结构基因序列测定鉴定为仙台病毒,命名为SV-HLJ。SV-HLJ与标准毒株Fushimi核蛋白基因(N)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99·6%和99·0%。结论分离并鉴定出了仙台病毒黑龙江省地方毒株,为检测试剂盒的研制奠定了基础。     

小鼠对仙台病毒Tianjin株易感性研究

研究129Sv、DBA/2、Kunming、BALB/c四种小鼠对仙台病毒Tianjin株的感染特点,并通过观察易感性的不同,确定适于研究此病毒致病性及疫苗的小型啮齿类实验动物。用9～11d龄鸡胚接种仙台病毒Tianjin株,72h后收集尿囊腔内效价为1:1 280病毒液,用5μl和6倍稀释的30μl病毒液分别接种129Sv、DBA/2、Kunming、BALB/c小鼠,观查12d小鼠体重变化,计算生存率。用6倍稀释的30μl病毒液接种Kunming、BALB/c小鼠,于接种前第1天以及接种后第4、7天断颈处死,取左肺制成切片,HE染色观察病理改变,综合判断仙台病毒Tianjin株对四种鼠感染的易感性的不同。129Sv、DBA/2小鼠在接种仙台病毒Tianjin株5μl后,最高平均体重下降分别为13.0%、4.7%,四种鼠12d生存率均为100%;接种稀释的30μl病毒液,129Sv、DBA/2、Kunming、BALB/c最高平均体重下降21.7%、30.3%、16.7%、9.6%;12d生存率分别为20%、0%、80%、100%。Kunming鼠在感染后第4、7d的肺组织病理改变较BALB/c严重,表现为大量炎细胞渗出,粘膜下层实质性增厚。以上实验结果表明DBA/2对仙台病毒Tianjin株感染最易感,BALB/c耐受性最强,易感顺序为DBA/2129SvKunmingBALB/c。DBA/2和129Sv小鼠可作为仙台病毒Tianjin株致病性及疫苗研究的首选实验动物。     

小鼠仙台病毒ELISA抗体检测规范化试剂盒的研制与应用

目的按照实验动物国家标准和农业部对于兽医诊断制品的要求研制小鼠仙台病毒抗体检测试剂盒,并在临床检测中分析其适用性。方法建立仙台病毒的种子批和BHK-21细胞的细胞库;标化仙台病毒生产工艺、抗原蛋白纯化工艺;优化ELISA反应板体系;标化质控血清。使用规范化的ELISA试剂盒对我单位672份送检血清样品进行检测,使用IFA和Western blot方法进行复检。结果病毒的种子批检验表明在-80℃保存半年以上毒力稳定;病毒生产和抗原纯化工艺的标准化提高了抗原生产的稳定性;对照体系的设定降低了环境等变量对于结果判定的影响。在对临床样本的检测过程中发现3种方法的灵敏度ELISA高于Western blot高于IFA。结论规范化的小鼠仙台病毒ELISA抗体检测试剂盒能对小鼠仙台病毒感染状况作出准确判断,具有一定的稳定性和结果可重复性。     

仙台病毒F基因的克隆及原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus)F蛋白主要抗原片段FP(S),并对表达产物进行免疫学初步研究。方法根据GenBank公布的仙台病毒F蛋白(gi:9627219)的基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR扩增出F基因的主要抗原片段FP(S),插入pMD-18-T载体中,鉴定正确后克隆入pQE31原核表达载体中,将鉴定正确的pQE31-FP(S)转化大肠埃希菌M15,IPTG诱导表达,对大肠埃希菌裂解物进行SDS-PAGE和Western-blot验证。结果大肠埃希菌表达的FP(S)相对分子质量约26×103,与预期相符;能与SeV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的FP(S)蛋白有良好的抗原性,为检测仙台病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。     

小鼠仙台病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

仙台病毒（Sendai virus, SeV）能够引起啮齿类动物呼吸道疾病,引起免疫应答,严重影响SPF级动物模型实验结果,实验动物质量国家标准T/CALAS49-2017也将其作为SPF级大小鼠质量检测必检项目之一。为了开发用于快速检测及日常监测SeV的分子生物学诊断方法,本研究基于TaqMan-MGB探针荧光技术,根据GenBank中SeV的L基因的保守区段（8 556-15 242）序列,设计了1对特异性引物与1条5‵端携带羧基荧光素（FAM）与3‵端为淬灭基团（Eclipse）标记的TaqMan探针,标准品进行稀释建立标准曲线,并经反应条件优化,建立了TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、敏感性与重复性进行评估。结果显示,最佳优化反应条件为：反应体系,20μmol/L;引物和探针浓度,10μmol/L和15μmol/L;退火温度,54℃;在特异性试验中,除SeV检测出现特异性曲线外,其他鼠类常见病毒均未出现特异性曲线;在敏感性试验中,Sev最低检测限为5.29×101拷贝/μL。在重复性试验中,其批内变异系数为0.44%～0.77%,批间变异系数为...     

仙台病毒BB1株基因组cDNA序列测定及比较分析

该研究对仙台病毒BB1分离株的cDNA全序列进行测序,通过RT-PCR法获得的4个相互重叠的质粒克隆覆盖了全长基因组,并将BB1全长序列与其它已知的仙台病毒序列进行比较。BB1株病毒的基因组为15 384个碱基构成,与其它已知仙台病毒基因组的基因排列与组成规律是一致的,未发现插入或缺失突变。与现已公布5个仙台病毒代表株全基因组序列比较发现,BB1株与其它仙台病毒株同源性均有较大差异。遗传进化分析结果显示,BB1株与Z株和Hamamatsu株的同源性仅为87%和91%,不属于这两株代表的进化分支而归属于第三个基因型。     

仙台病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白。方法根据GenBank上发表的仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白基因序列,设计并合成一对引物,通过RT-PCR扩增出核衣壳蛋白全长cDNA序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS,于37℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达,大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约60×103处出现一新蛋白带,与预期目的蛋白分子量相符。结果Western blot检测表明,表达产物能与兔抗SV阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,表明其具有免疫原性。结论为建立以重组NP蛋白为诊断抗原检测SV奠定基础。     

小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

目的制备标准化小鼠呼肠孤病毒III型（reovirus 3,Reo-3）免疫血清,建立小鼠Reo-3抗体ELISA检测方法。方法使用动物来源的Reo-3病毒感染BALB/c小鼠,获得高效价免疫血清;以BHK-21细胞制备Reo-3病毒抗原,同时制备做正常对照抗原。滴定抗原和标准化小鼠Reo-3血清的最佳工作浓度,进行特异性、敏感性、重复性、稳定性等实验。结果制备18 mL抗Reo-3血清,经检测,IFA效价达1∶640,IEA效价达1∶160;Reo-3抗原和标准化小鼠Reo-3免疫血清最佳工作浓度分别为5μg/mL和1∶2400;该ELISA检测体系Reo-3特异抗原批内变异系数为3.8%,批间变异系数为4.0%;检测灵敏度〉1∶4400;与仙台病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腺病毒（Mad）、小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠多瘤病毒（POLY）均无交叉反应。经37℃破坏性试验,2 d稳定性试验相对偏差〈27%。结论本研究制备的Reo-3抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠Reo-3病原的标准化质控血清。本研究建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。该体系可用于大、小鼠等实验动物Reo-3抗体的检测。     

非编码序列对仙台病毒HN基因表达的调控作用

仙台病毒的血凝素神经氨酸酶 (HN)蛋白在COS 7细胞中得到了表达 .结果表明 ,SRα启动子驱动HN基因表达的活性高于鸡 β肌动蛋白启动子 .而且 ,HN基因的 5′非编码序列能促进其表达 .Northern杂交证明 ,高表达是由HN mRNA转录引起 .为研究HN基因 5′编码序列对其转录的调控作用 ,用位点专一性突变分别以角蛋白基因和细胞色素P45 0基因的 5′非编码序列替代HN基因的 5′非编码序列 ,并分别缺失HN基因 3′非编码序列 ,构建了一系列表达载体 .以氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因为报道基因 ,用S1酶对HN mRNA转录量进行定量分析 .实验证明 ,HN基因 5′非编码序列能非特异性提高HN mRNA的转录 ,3′非编码序列对其转录也有某种特殊的调控作用 .     

刺参糖胺聚糖抗仙台病毒作用机制的探讨

目的:探讨刺参糖胺聚糖的抗仙台病毒(Sendaivirus,SV)作用及其作用机制.方法:选用不同浓度刺参糖胺聚糖作用于仙台病毒感染BHK21细胞的多个环节,倒置显微镜观察病毒致细胞痛变效应,MTT法检测细胞活性;同时以SV滴鼻感染小鼠,观察刺参糖胺聚糖对感染病毒小鼠血凝抑制抗体产生的影响.结果:刺参糖胺聚糖浓度大于3.2mg/ml时表现出细胞毒性作用.浓度在0.25～0.2mg/ml范围时,刺参糖胺聚糖作用病毒吸附组和病毒复制组能明显抑制细胞病变,MTT结果也表明该两组显示较好的细胞活性,且具有一定的量效关系,无细胞毒性作用;但SJ-GAG直接作用病毒组、预处理细胞组以及抑制病毒穿入组无明显抗病毒作用.动物实验表明刺参糖胺聚糖可促进小鼠血凝抑制抗体的产生.结论:刺参糖胺聚糖的抗仙台病毒作用主要通过抑制病毒对靶细胞的吸附以及抑制病毒复制而实现,并能促进小鼠对病毒感染的免疫应答.     

Gene delivery systems using the Sendai virus

Fusogenic liposome (FL) is a delivery system that can transfer encapsulated materials into living cells directly through membrane fusion. FL is a promising approach for gene therapy because it can deliver various genetic materials much more efficiently than other non-viral vectors without damaging the cell. FL-mediated gene transfer consists of two independent membrane fusion phenomena; generation of a FL by fusing a Sendai virus (SV) particle with a simple liposome encapsulating DNA, and successive fusion of the FL with cell membrane. The former requires viral F protein but no other special molecule on the liposomal membrane, whereas the latter may require the receptor (sialic acid) and unidentified assistant molecule(s) on the cell membrane. Further analysis suggests that these assistant molecule(s), not the receptor, may control the fusion and govern the cell specificity of FL-mediated delivery. This review has described a detailed analysis of these fusion phenomena and discussed possible applications of FL-mediated gene delivery to human gene therapy.     

超声波均质化对仙台病毒ELISA测试中抗原稳定性的影响

目的研究超声波均质化（homogenization）处理对于仙台病毒在ELISA测试中抗原稳定性的影响。方法对BHK-21细胞内扩增培养的仙台病毒通过差速离心,富集后使用超声波做均质化处理,和未处理的病毒分别包被酶标板,使用标准免疫小鼠血清和SPF小鼠血清对包被平板进行测试,比较样品测试孔间测量数据的变异率。结果对免疫血清做梯度稀释,各梯度样品在未经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在1.97%～6.02%之间;在经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在0.53%～2.26%之间;SPF血清测量值的变异率均高于免疫血清;所有样品在经超声处理的病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率均较小。结论超声波处理有效的提高了仙台病毒抗原的均质性,在ELISA测试中提高了抗原的稳定性。     

仙台病毒血凝素神经氨酸酶在哺乳动物细胞中的转录和翻译

仙台病毒的血凝素神经氨酸酶 (HN)在COS 7细胞中得到了表达。将具有表达功能的质粒转入非洲绿猴肾细胞LLCMK2 中 ,在抗生素筛选压力下连续传代 ,获得了具有抗生素抗药性的细胞系 ,表明HN基因已整合到该细胞的染色体中。尽管核酸酶S1实验结果表明 ,这些抗药性细胞内有大量HNmRNA的转录 ,但非直接免疫荧光和放射性免疫沉淀的结果却显示 ,细胞表面和细胞内部的HN蛋白的表达量很低。而仙台病毒持续感染的LLCMK2 细胞中却有大量的HN蛋白存在。这种转录与翻译不一致的现象 ,表明某些病毒因子对HN基因mRNA转录本的加工或翻译可能有正调控作用。同时也说明 ,在外源基因的表达过程中 ,没有可测定的表达蛋白也不一定就是没有该基因的转录。     

Effect of N-acyl-phosphatidylethanolamine on the Membrane Fusion Between Sendai Virus and Liposome

We have compared the properties of two N-acyl derivatives of dilauryl phosphatidylethanolamine on lipid polymorphism, vesicle leakage and Sendai virus fusion. The derivatives contained either an N-lauroyl group (NLPE) or an N-acetyl group (NAcPE). Only the NAcPE markedly affected the bilayer to hexagonal transition temperature of dielaidoyl phosphatidylethanolamine, shifting it to higher values. In contrast the NLPE slightly lowered this phase transition temperature. The two lipids also have opposite effects on leakage from small unilamellar vesicles of egg phosphatidylcholine. The NLPE inhibits leakage, while the NAcPE promotes it. This vesicle stabilizing effect of NLPE against leakage is not manifested in alterations of rates or extents of Sendai virus fusion to liposomes of egg phosphatidylethanolamine plus 2% ganglioside G_D1a. The NLPE has no effect, while the NAcPE reduces the observed fusion, at least in part as a consequence of a reduction in the final extent of fusion. These results demonstrate that the bilayer stabilizing effects of NLPE do not result in a lower rate of viral fusion. Furthermore, these bilayer stabilizing effects against leakage are not solely a function of the lipid headgroup but also require a structure with three long acyl chains. The reduced leakage is not related to a loss in monolayer curvature strain.     

Sendai Virus Fusion Activity as Modulated by Target Membrane Components

We have studied the differences between erythrocytes and erythrocyte ghosts as target membranes for the study of Sendai virus fusion activity. Fusion was monitored continuously by fluorescence dequenching of R18-labeled virus. Experiments were carried out either with or without virus/target membrane prebinding. When Sendai virus was added directly to a erythrocyte/erythrocyte ghost suspension, fusion was always lower than that obtained when experiments were carried out with virus already bound to the erythrocyte/erythrocyte ghost in the cold, since with virus prebinding fusion can be triggered more rapidly. Although virus binding to both erythrocytes and erythrocyte ghosts was similar, fusion activity was much more pronounced when erythrocyte ghosts were used as target membranes. These observations indicate that intact erythrocytes and erythrocyte ghosts are not equivalent as target membranes for the study of Sendai virus fusion activity. Fusion of Sendai virus with both target membranes was inhibited when erythrocytes or erythrocyte ghosts were pretreated with proteinase K, suggesting a role of target membrane proteins in this process. Treatment of both target membranes with neuraminidase, which removes sialic acid residues (the biological receptors for Sendai virus) greatly reduced viral binding. Interestingly, this treatment had no significant effect on the fusion reaction itself.