胞壁表达HSP65-IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建和鉴定

目的：获得胞壁表达结核分枝杆菌热激蛋白65（HSP65）和人白细胞介素2（IL-2）融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法：将HSP65和IL-2融合基因克隆入大肠杆菌-卡介苗（E．coli-BCG）穿梭质粒pCW,构建成重组质粒HSP65-IL-2-pCW,电穿入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选和PCR方法选取阳性克隆;用间接免疫荧光法对重组耻垢分枝杆菌进行表型鉴定;用重组耻垢分枝杆菌免疫BALB／c小鼠,检测其诱导的抗体水平。结果：筛选获得的重组耻垢分枝杆菌增殖特性与普通耻垢分枝杆菌无明显区别;与抗人的IL-2抗体和HSP65抗体均可形成免疫印迹条带;间接荧光染色后,可见细菌表面有极强的绿色荧光;重组耻垢分枝杆菌免疫BALB／c小鼠2周后,小鼠血清中HSP65抗体平均滴度为1：4000,而生理盐水组的抗体几乎为阴性。结论：结核分枝杆菌HSP65和人IL-2融合基因在耻垢分枝杆菌胞壁获得表达,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。     

结核杆菌Hsp65 与人IL-2 融合蛋白在耻垢杆菌表达

目的:构建能够分泌表达结核分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与人IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium Smegmatis,rMs)。方法:用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切含Hsp65-IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断Hsp65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中。重组质粒pDE22-hsp65-IL-2酶切鉴定正确后,电穿孔转化MS感受态,潮霉素抗性压力筛选阳性rMs。Western-blot鉴定rMs培养上清蛋白中目的蛋白的表达。结果:重组pDE22-hsp65-IL-2质粒酶切后可获得约2000 bp片段,与预期大小一致。Western-blot结果表明,rMs培养上清蛋白中有特异性反应条带,大小为78kD,与Hsp65-IL-2融合蛋白大小相一致。结论:成功构建了大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22-hsp65-IL-2,为该rMs的免疫学特性及抗结核分枝杆菌感染的保护效果研究奠定了基础。     

结核杆菌Hsp65与人IL-2融合蛋白在耻垢杆菌表达

目的：构建能够分泌表达结核分枝杆菌热休克蛋白65（Hsp65）与人IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（recombinant Mycobacterium Smegmatis,rMs）。方法：用EcoRV和HindIII双酶切含Hsp65．IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断Hsp65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中。重组质粒pDE22-hsp65-IL-2酶切鉴定正确后,电穿孔转化MS感受态,潮霉素抗性压力筛选阳性rMs。Westem—blot鉴定rMs培养上清蛋白中目的蛋白的表达。结果：重组pDE22-hsp65-IL-2质粒酶切后可获得约2000bp片段,与预期大小一致。Western-blot结果表明,rMs培养上清蛋白中有特异性反应条带,大小为78kD,与Hsp65-IL-2融合蛋白大小相一致。结论：成功构建了大肠埃希菌．分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22-hsp65-IL-2,为该rMs的免疫学特性及抗结核分枝杆菌感染的保护效果研究奠定了基础。     

IL-12增强HBV融合抗原DNA疫苗在小鼠诱导的细胞免疫应答

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)极易形成慢性感染,主要机制在于感染者不能产生强有力的细胞免疫应答以清除病毒[1].慢性HBV感染者体内虽然存在HBV抗原特异性T淋巴细胞,但对HBV抗原的反应性较低.研究发现,增强这类T淋巴细胞的反应性,可以促进HBV的清除[2].     

表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力

目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠,检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平;用结核分枝杆菌感染免疫小鼠,检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答,并能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量和病理损伤。结论:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠可诱导产生与卡介苗相当的保护作用,可能成为控制结核病的有效疫苗。     

寒冷应激对阿勒泰羊细胞免疫及热休克蛋白70 mRNA表达的影响

为研究不同的寒冷应激温度对阿勒泰羊(Ovis aries)细胞免疫及热休克蛋白70的影响。实验采集阿勒泰羊寒冷应激前后肝、肺、脾、淋巴结组织及血清,采用实时荧光定量PCR中最大二阶导数法(2-ΔΔCt)对各组织中hsp70的表达量进行统计学分析,同时采用ELISA方法测定血清中白细胞介素-4(IL-4)及白细胞介素-2(IL-2)寒冷应激前后浓度变化。结果显示,在寒冷条件下阿勒泰羊各种组织中热休克蛋白hsp70的表达都有所增加,尤其是脾组织的表达增加幅度较大。ELISA方法测定阿勒泰羊在寒冷刺激后IL-4浓度发生显著下降(P=0.016),而IL-2在冷应激后变化不显著(P=0.502),出现轻微的下调。研究表明,寒冷应激条件下,较高水平的hsp70能够保护机体免受应激的损伤。而在冷应激过程中,机体的免疫系统受到抑制。     

Hsp70与汉滩病毒S基因融合蛋白的原核表达及免疫小鼠的初步研究

本文构建了hsp70与S基因的原核融合表达载体pGEX-4T-1/hsp70-S,在大肠杆菌中表达,并通过GSTrapFF柱进行了纯化。同时制备了NP和Hsp70两种纯化蛋白。分别用这三种纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,结果表明纯化的NP和Hsp70-NP两种蛋白均可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)抗体,且后者刺激产生的抗体效价明显高于前者。淋巴细胞增殖实验表明,两组免疫小鼠的脾细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组免疫小鼠脾细胞对NP的增殖指数明显高于NP组免疫组。结果显示,与单独用NP免疫小鼠相比,Hsp70-NP纯化蛋白可以刺激机体产生更强的抗汉滩病毒体液免疫应答和特异性淋巴细胞增殖反应。     

Hsp70与汉滩病毒S基因融合蛋白的原核表达及免疫小鼠的初步研究

本文构建了hsp70与S基因的原核融合表达载体pGEX-4T-1/hsp70-S,在大肠杆菌中表达,并通过GSTrapFF柱进行了纯化.同时制备了NP和Hsp70两种纯化蛋白.分别用这三种纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,结果表明纯化的NP和Hsp70-NP两种蛋白均可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)抗体,且后者刺激产生的抗体效价明显高于前者.淋巴细胞增殖实验表明,两组免疫小鼠的脾细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组免疫小鼠脾细胞对NP的增殖指数明显高于NP组免疫组.结果显示,与单独用NP免疫小鼠相比,Hsp70-NP纯化蛋白可以刺激机体产生更强的抗汉滩病毒体液免疫应答和特异性淋巴细胞增殖反应.     

禽IL-2与传染性法氏囊VP2融合蛋白免疫学特性

为研究禽细胞因子IL-2与IBDV主要保护性抗原VP2基因融合蛋白的免疫学特性,将重组的rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡,通过IBDV-VP2 ELISA抗体效价、抗体亚型(IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的分泌水平、中和抗体以及动物攻毒试验检测评价其对鸡体免疫水平的影响。抗体滴度测定和淋巴细胞增殖试验结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡体的体液和细胞免疫应答水平均明显高于单独的VP2蛋白免疫组。抗体亚型测定结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明rVP2-IL-2融合蛋白能有效平衡Th1(γ-IFN)和Th2(IL-4)类型的细胞免疫反应。动物攻毒试验rVp2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体获得了85%的保护率,表明构建的rVP2-IL-2融合蛋白对IBDV的攻击具有较好的免疫保护作用。本研究为进一步研制IBD高效的基因工程疫苗奠定了基础。     

敲除pckA基因的结核杆菌引起的免疫反应的研究

研究结核杆菌pckA基因编码的磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)诱导机体产生的保护性免疫反应。用敲除pckA基因的牛结核杆菌BCG和野生型BCG分别感染小鼠,取肝、肺、脾进行病理分析,并进行脾细胞培养,检测CD4 、CD4 /CD8 、细胞因子IFNI-γI、L-12和TNF等。用敲除pckA基因的BCG感染的小鼠比野生型BCG感染的小鼠体内产生的结核结节少且不典型,炎性程度低。野生型BCG感染的小鼠脾脏内的CD4 T细胞和CD4 /CD8 、细胞因子IFN-γ、IL-12、TNF均明显高于敲除pckA基因BCG感染的小鼠。pckA基因为结核杆菌生长所必需,其编码产物PEPCK能够刺激机体产生免疫反应,是一种很好的疫苗候选分子。     

Immune Responses and Protective Efficacy Induced by 85B Antigen and Early Secreted Antigenic Target-6 kDa Antigen Fusion Protein Secreted by Recombinant Bacille Calmette-Guérin

In an attempt to improve immune responses and protective efficacy, we constructed two recombinant bacille Calmette-Guérin （rBCG） strains expressing an 85B antigen （Ag85B） and early secreted antigenic target-6 kDa antigen （ESAT6） of Mycobacterium tuberculosis （MTB） fusion protein. Both rBCG strains have the same protein insertion but in a different order （Ag85B-ESAT6 and ESAT6-Ag85B）. The cultured supernatant of rBCG strains and the sera from the mice immunized with the fusion protein Ag85B- ESAT6 or ESAT6-Ag85B formed a band with a fraction size of 37 kDa, equalivalent to the sum of Ag85B and ESAT6. Six weeks after BALB/c mice were immunized with BCG or rBCG, spleen lymphocytes showed significant proliferation in response to culture filtrate protein of MTB. Compared with the BCG group, mice vaccinated with rBCG elicited a high level increase of immunoglobulin G antibodies to culture filtrate protein in the serum. The T-interferon levels in the lymphocyte culture medium supernatants increased remarkably in the rBCG1 group, significantly higher than that of the BCG immunized group （P〈0.05）. Four weeks after vaccination, mice were infected with M. tuberculosis H37Rv and a dramatic reduction in the numbers of MTB colony forming units in the spleens and lungs was observed in the two rBCG immunization groups. Although these rBCG strains were more immunogenic, their protective effect was comparable to the classical BCG strain, and there were no significant differences between two rBCG groups （p〉0.05）.     

T细胞免疫在抗结核杆菌感染中的研究进展

结核分枝杆菌是引起结核病的病原体,该细菌可侵犯全身各组织器官。结核病是一种慢性传染性疾病,具有持久性特点。该细菌为胞内寄生菌,特异性免疫以细胞免疫为主,主要包括CD4+T细胞免疫和CD8+T细胞免疫。结核分枝杆菌特异性免疫应答的特点之一是感染早期T细胞免疫应答延迟。其机制与结核杆菌抑制免疫细胞(CD4+和CD8+T细胞及DC)凋亡延迟应答,通过特异性Treg细胞抑制作用延迟应答以及结核杆菌慢性感染期间存在IFN-γ信号调节网络和ESAT-6抗原的慢性刺激作用有关,以此可调节和维持免疫应答。深入了解抗原特异性T细胞特异性免疫应答的机制,有益于抗结核疫苗的研制,为临床工作提供理论依据和科学方法。     

T细胞免疫在抗结核杆菌感染中的研究进展

结核分枝杆菌是引起结核病的病原体,该细菌可侵犯全身各组织器官。结核病是一种慢性传染性疾病,具有持久性特点。该细菌为胞内寄生菌,特异性免疫以细胞免疫为主,主要包括CD4＋T细胞免疫和CD8＋T细胞免疫。结核分枝杆菌特异性免疫应答的特点之一是感染早期T细胞免疫应答延迟。其机制与结核杆菌抑制免疫细胞（CD4＋和CD8＋T细胞及DC）凋亡延迟应答,通过特异性Treg细胞抑制作用延迟应答以及结核杆菌慢性感染期间存在IFN-γ信号调节网络和ESAT-6抗原的慢性刺激作用有关,以此可调节和维持免疫应答。深入了解抗原特异性T细胞特异性免疫应答的机制,有益于抗结核疫苗的研制,为临床工作提供理论依据和科学方法。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6 和分泌蛋白 Hsp16.3 体外对人肝癌细胞HepG-2 的作用*

目的:探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hsp16.3对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法:将已构建的含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3,分别转入宿主菌E.coliDH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果:三种蛋白被成功纯化并复性。MTT数据统计分析显示,终浓度10μg/ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、80μg/ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强。不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别。结论:结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中的初步应用

目的：探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法：将已构建的含5种目的基因的表达载体（pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6）,分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2＋亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果：五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论：Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。     

HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗诱导小鼠持久的细胞免疫应答

构建编码HBV包膜-核心蛋白融合基因的DNA疫苗pSC、pSS1S2C和编码HBV包膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗pHBs、pHBc,分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应,比较融合基因DNA疫苗与单基因DNA疫苗诱生免疫应答的强度,发现融合基因DNA疫苗诱生抗体的效率明显不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强、更持久的细胞免疫应答,表明HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗对于治疗慢性乙型肝炎可能比单基因DNA疫苗更为有效.