Neurospora crassa phytase功能区基因phy A'的克隆表达及活性变化

目的:检测N.crassa phtase功能区基因phy A′表达的Phy A′活性变化。方法:先将N.crassa phy A′克隆到表达载体pPIC9K中,然后将获得的重组质粒pPIC9K-phy′转化到毕赤氏酵母中分泌表达,分离纯化重组酶Phy A′,并测定其酶学性质。结果:与原酶相比,N.crassa Phy A′的最适温度降低、热稳定性降低以及酶活力的降低。结论:N.crassa phtase N端的前12个氨基酸对维持该酶的功能有比较重要的作用。     

黑曲霉N-2植酸酶phy4基因的克隆及其重组酵母表达载体的构建

根据已发表的植酸酶phyA基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以黑曲霉N-2总DNA为模板,扩增出不包含假定信号肽序列的phyA基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为1350bp,与已发表的黑曲霉NRRL3135的phyA基因的同源性为92．4％(不计内含子),编码1个含449个氨基酸残基的蛋白质,推导的氨基酸序列同源性为95．1％。将该基因与分泌型载体pPIC9K连接,构建了植酸酶基因的重组酵母表达载体pPIC9K／phyA。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ,Bt)菌株S184中克隆了2.3kb大 vip3A基因并进行了序列分析。将vip3A-S184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19％是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）,斜纹夜蛾（S.litura)和棉铃虫（Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3A-S184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、表达及活性测定

利用PCR基因扩增法,以SARS冠状病毒全基因质粒为模板,获得N蛋白相应抗原基因,构建了表达载体pBV220／SARS-N,并在E．coli中获得高效表达。用纯化后的N蛋白抗原包被测定板,通过间接ELISA法对阴阳性血清进行活性测定,结果表明,在46份阳性血中有41份被测出,检出率为89．13％。本研究克隆并表达了SARS冠状病毒N蛋白,为进一步研制SARS病人抗体检测试剂和SARS疫苗奠定了基础。     

人EYA基因家族的克隆、表达及转录活性分析

采用PCR方法从人组织或细胞cDNA文库中扩增Eya基因家族的完整编码序列,将所扩增的基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾293T细胞,Western blot鉴定Eya基因家族的表达。检测Eya基因及其与Six基因共转染对MEF3-Luc转录活性的影响。经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,通过Western blot实验证明Eya基因家族真核表达载体构建成功。荧光素酶活性测定显示Eya能协同Six激活肌细胞生成素的表达。本研究进一步证实Eya是Six的转录共激活因子,能提高肌细胞增强因子的活性。     

霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达及重组蛋白活性分析

霍乱弧菌CTB蛋白具有免疫佐剂活性。本研究根据已发表CTB基因的序列设计一对引物,从一株霍乱弧菌中扩增出CTB基因,测序后发现该基因全长375 bp,与国内分离的六株CTB基因的同源性达96.0%～99.2%。将该基因与pTWIN1连接构建了原核表达载体pTWIN1-CTB,重组表达载体转化BL21（DE3）表达菌株,0.8 mmol/L IPTG诱导4 h后,收获的细菌总蛋白SDS-PAGE电泳显示CTB在原核表达系统中得到表达,融合蛋白大小与理论值符合,蛋白产量占细菌总蛋白的20%左右,主要以包涵体形式存在,western杂交和GM1-ELISA结果表明重组蛋白具有免疫原性和粘膜佐剂活性。     

黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达

目的:克隆植酸酶基因phyA,构建毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母,并对重组工程菌的表达产物进行初步酶学性质研究.方法:以植酸酶高产菌株-黑曲霉Z6染色体DNA为模板,PCR扩增得到植酸酶基因phyA,序列鉴定后连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-phyA,电击转化毕赤酵母KM71,筛选得到重组转化子.对重组工程菌表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究.结果:phyA序列分析表明该基因具有典型的植酸酶活性位点保守序列ArgHisGlyAlaArgTyrPro,与NC-BI已发表的植酸酶基因同源性较高,达到94%以上.该序列已提交GenBank,序列号为DQ318022.重组工程菌KM71-phyA7的PCR扩增证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中,植酸酶能有效分泌和表达,粗酶液酶活可达875U/mL.结论:植酸酶基因phyA在毕赤酵母中成功表达,为今后的定向改组奠定了基础.     

鲑鱼降钙素串联基因的克隆、表达及重组蛋白的生物学活性

目的：将鲑鱼降钙素(salmon calcitoni,sCT)基因以同向串联方式连接,构建串联多拷贝基因的表达质粒pHis-nCT(n≤3),并在原核中表达,研究表达产物的降钙活性。方法：采用半化学半酶促法合成sCT基因,利用基因的特点及特殊的酶切位点NdeI和SamI在表达载体pTrcHisC中进行sCT基因与载体基因的融合及sCT基因的串联,并在TOP10中表达串联多拷贝基因。表达产物形成包含体,对包含体变性、复性后,以Ni-Chelating Sepharose亲和纯化。用血清钙浓度测定法研究串联表达产物及裂解产物的降钙活性。结果：重组菌表达的串联融合蛋白经过变性、复性及亲合层析,纯度达到90％以上。活性试验表明,串联融合蛋白及其裂解产物可以抑制破骨细胞,降低血清钙浓度,且呈剂量效应关系。结论：原核表达质粒pTreHisC可以有效表达串联的sCT基因,重组的串联蛋白及裂解产物均有降钙活性。     

BRD7基因调控区的克隆与功能研究

BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆得到的一个新的Bromodomain基因(GenBank登录号AF152604).它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达BRD7基因能部分逆转鼻咽癌细胞的恶性表型.为了揭示BRD7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,利用生物信息学技术已预测出其启动子区.荧光素酶活性检测结果表明该区域具有强启动子活性;转录因子Sp1特异性地结合于BRD7该启动子区;Sp1特异性阻断剂mithramycinA能明显地抑制BRD7启动子的活性和BRD7基因的表达.     

牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区的克隆及其功能检测

通过基因组步移的方法扩增出一段924bp的牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区序列,在线软件分析表明5＇调控区内可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE／TRE、AP4等转录因子结合位点。采用DNA重组的方法,将克隆得到的5＇调控区片段插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1中,构建重组表达载体pEGFP-JFALP。重组载体瞬时转染COS-7细胞,在倒置荧光显微镜下可以检测到绿色荧光信号,且荧光信号随着时间的延长而增强。结果表明本实验克隆的牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区具有一定的启动子活性,为今后进一步研究碱性磷酸酶基因表达调控的分子机制奠定基础。     

cre基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白活性的检测

Cre重组酶来自噬菌体P1,可以识别特异的loxP位点的DNA序列,并进行专一性的剪切和拼接,利用PCR技术将cre基因克隆至原核表达载体pET-29a,在大肠杆菌BL21（DE3）得到了高效表达,采用DEAE－52柱层析的方法对表达蛋白进行了纯化,体外生物学活性检测表明,表达蛋白对含有同向loxP位点的质粒有切割活性。     

溶藻弧菌溶血活性检测及溶血素基因、启动子区功能

[目的]研究溶藻弧菌的溶血现象,溶血素基因vah的分布及vah基因、vah启动子区对溶藻弧菌溶血活性的贡献.[方法]对46株分离自华南沿海水生动物体内和海水的溶藻弧菌环境株及溶藻弧菌标准株1.1587进行溶血实验;比较具有溶血活性的溶藻弧菌野生株ZJ051、vah基因大肠杆菌BL21重组表达株、vah缺失突变株和基因回补株间溶血能力的差异;检测vah基因在溶藻弧菌中的分布,比较溶血株与非溶血株vah基因及上游启动子区的序列差异.[结果]47.8％的溶藻弧菌菌株产生溶血活性,因此溶血现象普遍存在于溶藻弧菌环境株中;vah基因的表达产物具有溶血活性,vah基因缺失突变株不具有溶血活性,而vah基因回补株恢复溶血活性.vah基因普遍存在于溶藻弧菌中,且基因序列非常相似,氨基酸序列完全相同,然而不同菌株的启动子区第188-190碱基位点存在差异.[结论]溶藻弧菌vah基因是造成溶藻弧菌溶血的直接原因,但溶藻弧菌溶血能力的差异并非是由vah基因本身差异决定,极有可能与启动子区第188-190碱基位点相关.     

产植酸酶菌株的筛选及其植酸酶基因的克隆

从土壤中筛选到产植酸酶活性较高的烟曲霉菌株WY-2,其植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃。通过对烟曲霉WY-2植酸酶基因进行PCR扩增,获得了一个1.5kb大小的特异性产物,将其克隆到载体pMD18-T中。测序结果分析表明,该基因片段含有植酸酶基因完整的阅读框架(ORF),基因全长1459bp,其中包含一个61bp的内含子,编码465个氨基酸,有7个潜在的糖基化位点,5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。该基因与已报道的烟曲霉ATCC34625植酸酶基因有91%同源性,编码的氨基酸序列同源性为91%。     

奶牛γ干扰素基因的高效表达及活性测定

经刀豆素(conA)刺激诱导奶牛外周血淋巴细胞,应用RT-PCR方法从其总RNA中对奶牛γ干扰素基因cDNA进行扩增,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,与已知序列同源性为100%。然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达,经SDS-PAGE分析,原核表达产物为16kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的42%,表达产物以包涵体形式存在。经7mol/L盐酸胍的变性液溶解及0.5mol/L盐酸胍复性液处理,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化,细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-γ具有较高的干扰素活性,约为6.0×105U/mg。     

人CNTF突变体(CNTFM)基因的克隆、表达和产物纯化及活性鉴定

采用PCR的方法对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得CNTF突变体基因(CNTFM) ,将CNTFM基因克隆入表达载体pBV2 2 0 ,在大肠杆菌BL 2 1(Gold)中进行了表达.目的蛋白占细胞总蛋白5 5 %左右,以包涵体形式存在,经Superdex 75凝胶过滤柱一步纯化和复性,获得纯度达90 %目的蛋白.纯化的重组CNTFM蛋白能促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,能明显减轻实验小鼠的体重,表明CNTFM具有良好的体内、体外生物学活性,为开发新型高效的减肥药奠定了基础.     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的鉴定、克隆及活性分析

【目的】鉴定我国自行分离的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）菌株中vip3A基因的分布和基因型,从其中对鳞翅目幼虫表现高毒力的Bt菌株中克隆vip3Aa基因。【方法】利用PCR-RFLP方法确定vip3A基因的分布和鉴定基因型,利用PCR方法克隆vip3A全长基因。【结果】171株野生型Bt菌株中共鉴定出63株含有vip3A基因,均与vip3Aa1类基因相似。从TF9和Bt16菌株中克隆得到2个vip3Aa基因,分别构建了携带vip3Aa基因的表达载体p30vip-26和p30vip-27,SDS-PAGE和Western Blot分析表明,IPTG诱导后均可表达88 kDa左右的Vip3A蛋白,蛋白可溶性分析表明约10%可溶。这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为vip3Aa26和vip3Aa27。生物测定结果显示,Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）3种重要鳞翅目害虫初孵幼虫的毒力较高,LC50值分别为0.125 μg/mL,0.238 μg/mL和9.238 μg/mL。而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾有活性,LC50值为4.423 μg/mL。【结论】本研究中的Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫均能表现高杀虫活性,而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾幼虫有活性,实验结果表明Vip3A蛋白个别氨基酸的变化对其杀虫活性影响很大。     

苏云金芽孢杆菌CrylAb13基因的克隆及表达研究

BtC005是我国自行分离的对多种害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌。经PCR-RFLP系统鉴定,它含有crylAb基因。Southern blot结果显示;PstI酶切C005质粒所得的8.5kb长的DNA片段为crylAb基因的阳性杂交带。以pUCP19为载体,克隆了该片段并证明其含有crylAb基因,对其进行亚克隆和测序,结果表明该基因编码区为3468bp,其编码的蛋白含1155个氨基酸,分子量为130.6kD,等电点为pH4.845。该基因已在GenBank基因库中注册,Accession number为AF254640,并为国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为crylAb13。将crylAb13基因在Bt无晶体突变株cryB^-中表达,蛋白质电泳结果表明在130kD处有表达带,并证明GryAb对小菜蛾有较高的杀虫活性。     

米曲霉植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已发表的植酸酶基因phyA序列(GI：4815609和GI：22901877)设计引物,以米曲霉(Asperillus oryae Cohn,编号：ACCC30155)的总DNA为模板,利用PCR扩增得到目的片段。将此片段克隆到表达载体pPIC9K的EcoRI酶切位点构建重组质粒,通过电转化方式将重组质粒转化毕赤酵母(Pichia pastoris)。检测结果表明,植酸酶基因在毕赤酵母中得到了表达。     

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS(2.56kb)克隆于分泌型原核表达载体pET32a( )上,以N端融合6个组氨酸的形式在E.col AD494(DE3)中进行了IPTG诱导表达。SDS－PAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的35％左右,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni^2 )配体亲和层析柱纯化目的蛋白,其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别,结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。     

烟曲霉WY-1植酸酶基因的克隆及其在烟草中的表达

大连理工大学环境与生命学院生物工程系王严、高晓蓉、苏乔等生物工程科研工作者以自行筛选的烟曲霉WY-1为出发菌株。通过PCR方法克隆其植酸酶基因，并构建了含有植物信号肽序列的植酸酶基因植物表达载体。他们利用农杆菌介导的叶盘法对烟草叶片进行了遗传转化。