单质粒模式诱导表达载体系统的建立

在Invitrogen公司T-Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导24 h后目的基因的表达水平提高了8.9倍,表明单质粒模式载体基因诱导表达的应用具有可行性.     

四环素诱导组织特异性表达系统的构建

如果获得一种可以特异调控基因表达的系统,对于研究某一基因在各个不同发育时期的功能会有很大的帮助.为了控制外源基因在特定的时间和组织内在转基因植物中表达,将四环素诱导元件和花药绒毡层特异表达启动子TA29结合,构建了一个新的系统.通过基因枪将该系统转入烟草(Nicotiana tabacum L. cv.Wisconsin 38)组织,GUS瞬时表达结果表明,四环素诱导前,没有任何烟草组织染上蓝色,表明该系统不表达;而四环素诱导仅30min后,花药就染上明显蓝色,而且集中在花药绒毡层.其对照子房在四环素诱导前和诱导后均未染上蓝色.这些结果表明,该系统既是四环素诱导又是花药绒毡层特异表达的.     

四环素诱导组织特异性表达系统的构建

如果获得一种可以特异调控基因表达的系统。对于研究某一基因在各个不同发育时期的功能会有很大的帮助。为了控制外源基因在特定的时间和组织内在转基因植物中表达。将四环素诱导元件和花药绒毡层特异表达启动子TA29结合。构建了一个新的系统。通过基因枪将该系统转入烟煤草（Nicotiana tabacumL.cv.Wisconsin38)组织,GUS瞬时表达结果表明,四环素诱导前,没有任何烟草组织染上蓝色,表明该系统不表达;而四环素诱导仅30min后,花药就染上明显蓝色,而且集中在花药绒毡层,其对照子房在四环素诱导前和诱导后均未染蓝色。这些结果表明。该系统既是四环素诱导又是花药绒毡层特异表达的。     

四环素诱导调控表达系统的研究与应用

四环素(Tet)诱导调控表达系统是在大肠杆菌Tn10转座子中特异的Tet抗性操纵子基础上建立起来的一种用于诱导基因表达的调控系统。经过近几年来的发展,衍生出了Tet-on、Tet-off两套调控系统;随着对Tet诱导调控表达系统的改进,其对基因表达调控的严谨性、诱导效率及安全性等方面逐步得到改善,并被广泛应用于基础研究及体内外的实验治疗研究。此外Tet诱导调控系统与其他诱导调控体系及新兴技术的联合应用,为疾病的基因治疗研究提供有力的手段。     

一株受四环素及其衍生物诱导表达的Tet-on鼻咽癌细胞系

Ｔｅｔ－ｏｎ基因表达系统是新近发展的一种真核生物体外表达系统．该系统利用四环素及其衍生物对所感兴趣基因进行诱导表达．这种诱导表达具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点．对于研究一些致死基因及毒性强的基因在细胞或体内的表达提供了极好的工具．利用Ｔｅｔ－ｏｎ基因表达系统,构建了一株鼻咽癌细胞系,该细胞系的建立为进一步研究一些鼻咽癌发病相关基因,如ＥＢ病毒潜伏膜蛋白基因、瘤基因、抑瘤基因等与鼻咽癌的相关性,提供了理想的细胞模型．     

高效缺氧诱导表达载体的构建与鉴定

目的：构建缺氧诱导表达载体,以介导报告基因在缺氧环境下的特异、高效表达。方法：通过分子生物学方法,将鼠磷酸甘油酸激酶基因的缺氧应答元件（HRE）和最小CMV（mCMV）启动子重组,构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或萤光素酶报告基因的可诱导载体;通过酶切鉴定和测序分析,证实载体获得正确的构建;将重组载体转染HeLa细胞,观察EGFP荧光强度并检测萤光素酶活性。结果：HRE／mCMV启动子调控的报告基因载体具有特异和高效的诱导活性。结论：构建了可以进行特异和高效缺氧诱导的报告基因载体,为其进一步的开发和应用奠定了实验基础。     

解纤维梭菌脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统构建

【背景】解纤维梭菌是发酵木质纤维素生产乙醇的中温模式菌株,构建可控诱导的基因打靶技术是研究解纤维梭菌遗传调控的重要手段。【目的】在解纤维梭菌中构建脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统。【方法】首先,分析解纤维梭菌对脱水四环素的敏感性,筛选合适的诱导剂浓度,并以β-葡萄糖苷酶为报告基因,检测其在解纤维梭菌中的诱导效果。然后,将脱水四环素诱导型操纵子与II型内含子元件组合,构建脱水四环素诱导的ClosTron质粒。最后,以解纤维梭菌mspI、ldh和ack为例,检测其在解纤维梭菌中的打靶效率。【结果】脱水四环素诱导系统在解纤维梭菌中能够诱导ClosTron元件表达,在mspI、ldh和ack这3个基因位点的打靶效率分别为29.48%±15.51%、23.61%±7.08%和28.09%±6.97%。【结论】在解纤维梭菌中成功构建脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统,为梭菌基因工程改造奠定了基础。     

猪Nanog基因四环素诱导干扰载体的构建和鉴定

Nanog基因是在早期胚胎和干细胞等多能性细胞中特异表达的重要基因,但有关猪Nanog基因功能的相关研究甚少。四环素诱导干扰载体是一种可通过四环素等药物条件性诱导干扰目的基因的载体,尤其适用于在发育过程中起着关键作用的基因沉默。常规的四环素干扰系统为二元载体,与一元载体相比获得针对特定基因干扰的稳定细胞系所需周期更长。首先通过构建pGenesil 1.0-shRNA重组干扰载体,瞬时转染稳定过表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞后通过Realtime-PCR筛选出干扰效率可达80%以上的干扰片段。之后将筛选得到的干扰片段插入到改造的一元四环素诱导干扰载体TREsilencer,对稳定表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞进行了瞬时转染。实验分别通过光密度检测以及Realtime-PCR检测了不同浓度doxycycline的诱导效率和干扰效率。结果表明,所构建的四环素诱导干扰载体TREsilencer-shRNA5随着四环素浓度的增加,诱导Nanog基因的干扰效率增加,在处理浓度为1μg/ml时干扰效率可达70%以上,为后续得到可诱导的稳定干扰猪Nanog基因的细胞系和进一步研究猪Nanog基因功能奠定了基础。     

四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼模型建立

目的探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法构建肝脏特异启动子fabp10启动rt TA蛋白表达的重组质粒pfabp10-rt TA,联合p TRE-Tight-BI-Ac GFP1质粒转染He La细胞后给予doxycycline诱导,Western blot法验证;pfabp10-rt TA联合p TRE-Tight-BI-Ac GFP1质粒注射斑马鱼1-细胞期受精卵后,30μg/m L doxycycline诱导,荧光筛选稳定整合个体。结果共转染pfabp10-rt TA与p TRE-Tight-BI-Ac GFP1的He La细胞经1μg/m L浓度doxycycline诱导培养液诱导,GFP表达量显著高于不加doxycycline培养液对照组;筛选获得的稳定整合斑马鱼幼鱼,在浓度为30μg/m L doxycycline条件下,肝脏明显有绿色荧光表达,对照组幼鱼肝脏位置未有明显绿色荧光。结论 Tet-On四环素诱导表达系统可用于建立四环素调控斑马鱼肝脏特异表达外源基因;利用该技术可建立诱导肝脏表达GFP建立转基因斑马鱼品系,为建立条件型转基因斑马鱼疾病模型、探索肝脏器官发生发育等研究提供良好的模式动物工具。     

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H。首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-TpepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48。然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应。     

Tet system的调控原理及其在转基因小鼠模型上的应用

基因表达的调控是分子生物学研究的一个重要问题,也是基因治疗和基因功能研究的重要手段。诱导性基因表达系统可以从时间上调控基因的表达,是基因治疗和基因功能研究的重要工具之一。其中,四环素诱导基因表达系统(tetracycline inducible expression system,Tet system)是应用最广泛的一种,它可以在时间和空间上对基因进行严谨和高效地诱导表达。基于该系统获得了不同用途的转基因动物,这些模型动物的建立为研究特定基因的功能及其在疾病发生中的作用打下了实验基础。现就四环素诱导表达系统的原理和在小鼠模型上的研究应用做一综述。     

Retro-Tet:一种基于逆转录病毒的诱导性基因表达系统

 Retro Tet基因表达系统是一种新型的高效、稳定、无毒、具有严密开 关功能的可诱导性真核细胞基因表达系统 .该系统兼备了逆转录病毒基因表达系统和Tet off Tet on基因表达系统的优点 ,在稳定表达细胞系的筛选、基因的表达与调控及基因功能研究等方面得到了成功的应用 ,同时也为基因治疗提供了一种理想的基因载体系统     

通用真核质粒表达载体的构建

利用真核基因表达调控的原理,以pSV2-dhfr为起始材料,构建了两个通用的真核质粒表达载体pMAML1-dhfr和pMAML2-dhfr,它们包含人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子调控元件,由两个转录方向相同或相反的表达单元组成.以荧火虫荧光素酶基因为报道基因,β-半乳苷酶基因为内对照,借助COS-7短暂表达系统,研究了它们对荧光素酶表达的影响,并比较了它们与出发载体pSV2-dhfr的相对强弱.     

重组DNA技术中可诱导的基因表达调控系统

在重组DNA技术中,可诱导的基因表达调控系统可被用来调节目的基因的表达以达到基因功能研究、转基因动物研究、以及基因治疗研究等目的。该系统主要由诱导剂、可诱导的受体或转录因子、顺式作用元件以及载体系统四部分组成。本文以诱导剂为分类依据,叙述目前主要的6类可诱导的基因表达调控系统:类固醇激素受体诱导的基因表达调控系统、四环素诱导的基因表达调控系统、缺氧诱导的基因表达调控系统、高热诱导的基因表达调控系统、电离辐射诱导的基因表达调控系统和lac基因表达调控系统。     

可调控小鼠尿激酶原激活剂真核表达载体的构建及其在Huh7细胞中的表达

目的：建立基于Tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂（uPA）的诱导表达系统。方法：提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与pTet-on瞬时共转染Huh7细胞系,24h后用强力霉素诱导表达,诱导后36h分别收集细胞和培养上清（诱导组）,提取细胞总RNA并进行细胞uPA转录水平的检测;采用溶圈法对细胞分泌至培养上清中uPA的生物活性进行检测,同时以转染但未诱导Hun7（未诱导组）和正常培养Huh7（正常对照组）细胞及培养上清作为对照。结果：与未诱导组和正常对照组相比较,仅诱导组在转录水平上扩增出目的条带;溶圈法证实转染的细胞不仅表达uPA,而且表达的蛋白具有一定的生物活性。结论：构建了可调控的uPA真核诱导表达系统,为进一步制备可调控肝细胞表达uPA转基因小鼠及进一步揭示uPA肝损伤机理奠定了基础。     

四环素诱导可控表达细胞周期素B1单克隆的筛选

目的筛选四环素诱导细胞周期素B1（CyclinB1）可控表达的293单克隆细胞株（tetracycline-regulated expression 293 cells,T-REx^TM-293）。方法从人胎肝cDNA文库中PCR带有酶切位点的CyclinB1基因全长,将其酶切后插入到pcDNA4／TO／myc-HisB载体中。然后用测序正确的质粒转染T-RExTM-293细胞,加杀稻瘟菌素（Blasticidin）和腐草霉素（Zeocirt）双药物筛选两周后,传96孔板,等单个细胞扩增出单克隆。然后用Western印迹和流式细胞仪检测CyclinB1的诱导表达情况。结果构建好的pcDNA4／TO／myc-HisB—CyclinB1载体,经鉴定序列正确。筛选出的单克隆细胞株,在未加四环素时没有外源性的CyclinB1表达,在加入四环素后,3h就有表达,随时间的增加,CyclinB1表达量也增加,48h最多。结论筛选出的T-REx^TM-293单克隆细胞株能可控表达CyclinB1。     

Inducible gene expression with the Tet-on system in CD4+ T cells and thymocytes of mice

CD4+ T cells with their growing list of effector and regulatory subpopulations have vital functions within the immunohematopoietic system. We report here on the first mouse lines that allow temporally and quantitatively controlled expression of transgenes specifically in CD4+ thymocytes and T cells. These were constructed using the Tet-on system. The rtTA2(S)-M2 version of the reverse tetracycline-dependent transactivator was placed under control of all known CD4 regulatory elements. Reporter transgene expression in mice expressing these constructs is highly specific for CD4+ cells, is strictly dependent on the tetracycline derivative doxycycline, and can be regulated by up to five logs depending on the doxycycline concentration. Moreover, we demonstrate that these mice can be used for noninvasive in vivo imaging of a coexpressed luciferase reporter. These new mouse lines should be highly valuable for studying and manipulating numerous aspects of CD4+ T cell development, biology, and function.     

肌肉注射可调控胰岛素基因对糖尿病小鼠降糖作用

为研究四环素调控的胰岛素表达载体肌肉直接注射后对实验性糖尿病小鼠的降糖作用,构建了质粒prTA-tet4-rhINS.以链脲佐菌素(STZ)诱导Balb/C小鼠成糖尿病模型,300 μg质粒注射至小鼠的股部肌肉,并同时在饮水中加入不同浓度强力霉素（Dox）,监测小鼠末梢血糖、体重,测定血清人胰岛素、C肽水平.用RT-PCR检测小鼠肌肉注射部位组织中人胰岛素原mRNA水平的表达情况.结果表明：质粒prTA-tet4-rhINS注射后,给予Dox可显著降低糖尿病小鼠的血糖,血清人胰岛素、C肽水平相应升高,体重增加.效果持续大约二周.小鼠肌肉组织中有人胰岛素原mRNA表达.降糖效果和基因表达程度随Dox浓度增加而增强.质粒prTA-tet4-rhINS对STZ诱导的糖尿病小鼠高血糖起到明显的降低作用.在糖尿病小鼠肌肉组织能很好地表达,并受Dox调控.