大麦条纹花叶病毒新疆株3''''端基因组的克隆及分析

我们应用多次加尾的方法,对大麦条纹花叶病毒新疆株的RNAs基因组进行克隆。在所述条件下可以合成2000～3000核苷酸长度的cDNA。通过原位杂交、转印杂交(Northern blot)证明所得克隆属于RNA_1和RNA_3组分,并包含有3′端基因组结构。对部分克隆进行了酶谱分析。     

新疆大麦条纹花叶病毒的研究 Ⅱ.病毒核酸cDAN的合成及克隆

本文采用改进的新技术从大麦条纹花叶病毒核酸合成互补脱氧核糖核酸,重组质粒及选择特异性克隆。由于技术的改进,简化了操作程序,提高了工作效率。我们以大麦条纹花叶病毒三个组分核酸混合物为模板,寡(dT)8为引物,合成cDNA第一条链,用Gubler和Hoffman缺口翻译法合成第二条链,采用加HindⅢ人工接头的方法将cDNA插入pUC 9质粒载体上,于大肠杆菌JM-103中进行克隆,并以克隆颜色变化表示有无β-半乳糖苷酶活性的直观法,选择含有外源DNA的克隆。再以克隆原位分子杂交法检查克隆对病毒RNA各组分的特异性。仅对RNA_1或RNA_2有特异性的克隆,分别称为pBV_1和pBV_2,另有相当数量的克隆既与RNA_2也与RNA_3杂交,所以称为pBV2 3。用HindⅢ内切酶对一部分RNA_3杂交阳性的PBV2 3进行分析表明,插入的外源基因长度在500～1,000碱基对之间。文中讨论了RNA_2与RNA_3存在同源的可能性。     

应用限制性显示PCR技术构建细菌poly(A)化mRNA的cDNA文库

针对细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,以oligo(dT)一纤维素纯化mRNA,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,用限制性内切酶消化cDNA,所得的限制性内切酶片段与通用接头相连,通过10个选择性引物组合进行选择性PCR,使各片段得以扩增并分布于10个亚组中,并进行克隆,成功地克隆了100多个基因片段,已对其中40个进行了测序分析,探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA cDNA库构建中的应用价值。     

互补DNA杂交分析和血清学方法对香石竹环斑病毒分离物的研究

在联帮德国奥卡河中分离到一种病毒分离物(W),通过鉴别寄主反应的测定,病毒粒子的电子显微镜观察,cDNA斑点杂交和血清学的研究,鉴定出这一病毒分离物为香石竹环斑病毒。其外壳蛋白亚基的分子量为3.8×10~4。cDNA吸印转移杂交分析表明,香石竹环斑病毒的两个RNA组份(RNA~1、RNA_2)之间没有核苷酸序列同源性。RNA_1和RNA_2分别由3.7和1.5仟碱基组成。     

大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 3′端结构分析

本文利用双脱氧序列分析法对我国大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 cDNA的3′端进行序列分析,证明XJ株RNA2 3′端239个核苷酸与国外典型株3′端相应部位有高度的序列同源性。通过序列分析及使用寡核苷酸定位裂解法和分子杂交确定,在紧邻239个核苷酸的上游有一个Poly(A)结构,3′终端为一个类tRNA结构,亦与国外典型株相同。经分析认为BSMV-XJ3个基因组RNA具有相同的3′端结构。     

大麦条纹花叶病毒(新疆株)中多聚腺苷酰核糖核酸含量、侵染活性及多聚腺苷酸链长分布的测定

1.用Oligo(dT)纤维素亲和层析将新疆大麦条纹花叶病毒(BSMV-XJ)RNA分为poly(A)~+(与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA和poly(A)~-(不与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA,其相对含量poly(A)~+RNA占75%,poly(A)~-RNA为25%。2.用~(32)P标记法测定了BSMV(XJ)RNA中3′端poly A的链长分布,结果poly(A)~+RNA带有数个至三十几个腺苷酸残基,而poly(A)~-RNA也含十个以下的腺苷酸残基。3.用系统感病寄主大麦进行侵染性试验表明,poly(A)~+RNA与poly(A)~-RNA对大麦具有同等水平的侵染性。4.文中讨论了Oligo(dT)纤维素的分离效果以及所用测定poly(A)链长分布方法的可靠性。     

鲑鱼生长激素cDNA的分子克隆和序列分析

从太平洋切奴克鲑鱼(Pacific Chinook Salmon,Oncorthychus tschawytscha)垂体poly(A)~+ RNA构建cDNA文库。按照鲑鱼生长激素(sGH)部分氨基酸序列合成两个寡聚脱氧核苷酸探针,它们分别与编码第1—7和第166—172氨基酸序列互补。用探针筛查cDNA文库,得到了完整的sGH cDNA克隆。cDNA序列已测定,包括编码210个氨基酸的编码序列。其中含有22个氨基酸的信号肽序列和188个氨基酸的成熟GH序列。该克隆还包括了5'端和3'端非翻译区,分别为72个和438个碱基对长。与Chum鲑鱼比较表明,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为97%和99%。     

凝乳酶原mRNA的分离及其cDNA克隆的鉴定

用异硫氰酸胍法从牛胃粘膜组织中分离到poly(A)RNA。经电泳分析、体外翻译活性分析及No rIhern转移杂交分析,结果表明,poly(A)RNA中含有完整的,具有生物活性的凝乳酶原mRNA,大小为16S。从poly(A)RNA建立的cDNA库中,以C500-pepsinogen为探针进行初级筛选,集中阳性克隆成为凝乳酶原和相关胃蛋白酶原cDNA富集库。从寓集库中选出插入片段带有凝乳酶原基因所特有的EcoRI切点的19个克隆。经限制性内切酶谱分析确定pcT 5为凝乳酶原基因克隆,其5’端缺少80bP。以pCT 5的插入片段为探针,从cDNA库中进一步筛选得到pCTl5。酶谱分析表明,pcTl5的两端均足以覆盖编码区域,而在917位左右约有110bP的缺失。从而不仅充分证明了分离的poly(A)RNA中含有全链长的凝乳酶原mRNA,而且还可通过拼接pCT5及pCTl5获得完整的凝乳酶原基因。     

苜蓿豆血红蛋白互补脱氧核糖核酸(cDNA)的合成及其无性繁殖

本文介绍了 cDNA 合成的详细方法。用苜蓿豆血红蛋白 poly A( )mRNA 作模板,在反转录酶作用下合成单股 cDNA(ss-cDNA),然后在 E.coli DNA 聚合酶 I 作用下合成双股 cDNA(ds-cDNA)。采用同聚物尾接方法和合成的内切酶寡核苷酸衔接物连接方法,将 ds-cDNA 与质粒 pBR322 DNA 重组,进行转化,得到对氨苄青霉素抗性(Amp~r)和四环素敏感(TeL~s)的75个转化子。经 cDNA-mRNA 的杂交选择和无细胞体外转译的初筛结果,有两个转化子具有与苜蓿豆血红蛋白 mRNA 有同源性的 cDNA。这种 cDNA 的性质有待于进一步研究.     

表达基因鉴定的一种新策略：筛选poly（dA／dT）—cDNAs

低丰度表达基因及组织细胞等特异基因的鉴定是人类表达基因鉴定的瓶颈,Wang等认为cDNA中的长序列poly(dA/dT)是限制低丰度表达基因等鉴定效率的主要原因,为此提出了一种新策略,即用3′端锚定oligo(dT)11代替常规oligo(dT)引物逆转录合成cDNA,并将3′端携带11个（dA/dT)s序列的cDNA称之为poly(dA/dT)^-cDNA,筛选poly(dA/dT)^-cDNAs差减文库可以提高这些基因的鉴定效率。     

斑马鱼Gfi1.1基因的克隆及其体外转录

目的:克隆斑马鱼Gfi1.1基因的全长cDNA,运用T7 RNA聚合酶对含有Gfi1.1基因的ORF区进行体外转录,在体外合成5端带有帽子结构的Gfi1.1 mRNA分子,为后续研究斑马鱼Gfi1.1基因的功能打下基础。方法:应用RT-PCR从斑马鱼组织中扩增出Gfi1.1 cDNA片段,经回收纯化与pGM-T载体连接并转化感受态细菌DH-5α,通过蓝白筛选酶切鉴定阳性菌落,小量提取质粒,Nde I限制性内切酶线性化pGM-T-Gfi1.1质粒,运用T7 RNA聚合酶对Gfi1.1基因进行体外转录及加帽。经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得约1.2 kb的DNA片段,DNA序列分析的结果与GenBank上的序列(NM_001020776)一致,酶切线性化及体外转录加帽pGM-T-Gfi1.1,凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。结论:成功克隆斑马鱼Gfi1.1基因并体外转录及加帽pGM-T-Gfi1.1。     

Molecular Cloning and Characterization of Stored mRNA in Cotyledons of Vigna unguiculata

From a gt1O cDNA library constructed from the total polyadenylatedRNA (poly A⁺ RNA) of mature cowpea cotyledons, we selected recombinantphages that hybridized with a cDNA probe complementary to polyA⁺ RNA from cotyledons collected 24 h after the onset of imbibition(cDNA-B) but that did not hybridize with a probe from cotyledonsat developmental stage II (13 to 15 days after flowering; cDNA-A).cDNA inserts of two of these phages were subcloned in pUC18plasmids and the resultant plasmids were designated pSAS5 andpSAS1O, respectively. We also selected two recombinant phagesthat hybridized with cDNA-A but not with cDNA-B, and one ofthem was subcloned in pUC18 to generate pSASC1. We then characterizedthe pSASlO cDNA insert as the cDNA of a putative stored mRNAof cowpea seeds and the pSASC1 insert as a reference cDNA. TheRNA-blot hybridization after gel electrophoresis, with pSAS10as probe, indicated that an essentially full-length cDNA hadbeen cloned, and the hybrid-select translation of pSAS10 mRNAgave a 10-kDa product. pSASC1 mRNA was shown to code for a 46-kDapolypeptide, which corresponds in size to one of the major storageproteins of the cowpea. pSAS10 mRNA was detectable only in cotyledonsat developmental stage III (17 to 19 days after flowering) orlater, and the level of the mRNA began to decline when seedsgerminated. The mRNA was also present in cowpea embryonic axes.mRNA hybridizable to pSAS10 cDNA was found in extracts of someother plants. (Received July 17, 1989; Accepted October 17, 1989)     

嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA 文库的构建和亲环蛋白基因序列的初步分析

实验利用灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导处于四龄池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)14h,将诱导后的池蝶蚌血细胞的总RNA 进行逆转录, 用LD-PCR 法合成双链cDNA, 从而首次成功构建池蝶蚌血细胞的全长cDNA 文库。原始文库的滴度为4106 cfu/cm3, 重组率为90%, 扩增后文库的滴度为3.55109pfu/mL。目前文库已随机测序672 个样品, 将所得双向序列进行拼接, 去除载体, 并多序列比对去除重复序列后, 发现436 条为已知功能序列, 其余为未知功能序列。序列中最小长度270 bp, 最大长度为2153 bp, 平均大小608.6 bp, 表明插入片段大小理想。从文库中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋白A(HsCyp A)全长基因并进行序列分析。结果显示, HsCyp A 全长1229 bp, 序列包括52 bp 的5非编码区、495 bp 的开放阅读框、682 bp 的3非编码区和29 bp 的poly(A)尾, 没有明显的加尾信号。对Cyp A 氨基酸序列二级结构进行了较详细的分析并进行了三维建模, 同时构建了其系统进化树, 分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非常保守的蛋白家族。综合分析, Cyp A 在水生动物中不仅仅只是一种组成型蛋白, 而是可能在病原感染防御中发挥重要作用。