流行性出血热病毒在长爪沙鼠肺肾原代细胞中增殖

将来源于黑线姬鼠肺,褐家鼠肺和流行性出血热(EHF)病人血液的三株 EHF 病毒,在长爪沙鼠肺、肾细胞中传代培养。接种后第一代就能很好增殖,滴度可达10~(6·0-6·5)TCID50/ml。随着传代次数的增加,病毒增殖速度加快,第三代在接种后2天即可检出感染细胞,4—8天有50%左右的细胞感染。经传九代未见明显的细胞病变。病毒增殖的高峰在接种后9天左右。维持液中有牛血清,冻融和超声波处理能提高病毒滴度。不同温度(33℃和37℃)和 pH(含5%和3%CO_2)培养对病毒增殖无明显影响。经传代的感染细胞仍能与 EHFV 单克隆抗体起反应,并排除ⅠⅡⅢ面型呼肠孤病毒的感染。     

火鸡疱疹病毒在鸡胚成纤维细胞上有效代次的测定及其免疫原性恢复的研究

本试验证明,火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株在鸡胚成纤维细胞(CEF)传55代的病毒,仍有预防马立克氏病(MD)的效力,至第70代效力明显下降。若将HVT CEF第35代病毒复归火鸡连续传4代,能明显恢复其免疫原性,用C细胞传代则有效代次可达到75代。因而,此方法能有效地解决免疫原性下降的种毒的更新问题。本试验还为该种毒和疫苗的有效代次的使用范围提供了可靠依据。     

应用细胞工厂传代原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒

目的应用细胞工厂建立原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞传代培养工艺,培养狂犬病病毒,为PHK细胞和人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的规模化放大奠定基础。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,经消化分散接种到细胞工厂中,在37℃下培养筛选出PHK细胞静置培养的最适细胞接种密度;在最适细胞接种密度下,从0.20%水解乳蛋白MEM培养基和改良的DMEM/F12培养基中筛选出更适宜地鼠肾细胞静置培养的培养基;同时对消化液A(含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.25%胰蛋白酶溶液)的消化效果进行比对,选择适宜的消化液;最后,使用最佳培养基和消化液对PHK细胞进行传代,观察细胞生长情况并分析代谢水平;对同一细胞批不同代次的单层细胞(P0代、P1代和P2代)接种狂犬病病毒aG株,进行多次收获,检测单次病毒收获液病毒滴度。结果 PHK细胞(P0代)在细胞工厂中适宜的接种密度为0.30×10~6～0.50×10~(6 )cells/cm~2;改良的DMEM/F12培养基和消化液B更适用于PHK细胞的培养和消化传代;在40层细胞工厂(CF40)中使用最佳培养基和消化液传代地鼠肾细胞至第4代(P4代),随着代次的增加,收获的细胞密度降低、葡萄糖消耗减少和乳酸生成下降;P0代、P1代和P2代细胞均有较佳的细胞状态和增殖能力;用P0代、P1代和P2代细胞培养狂犬病病毒,能有效收获4次,且单次病毒收获液病毒滴度结果符合要求,差异无统计学意义(P0.05)。结论成功建立了PHK细胞传代培养工艺,为PHK细胞的规模化放大,冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产工艺的改进、变更以及产能的扩大提供了参考。     

共表达禽流感病毒HA和NA基因重组禽痘病毒的遗传稳定性

将表达禽流感病毒H5HA及N1NA基因的重组禽痘病毒rFPV HA NA连续传代至 2 5代 ,取第 5、15及 2 5代重组病毒作为受检代次 ,进行外源基因的PCR扩增与测序 ,同时比较这 3个代次重组禽痘病毒的免疫效力。结果对各代次重组病毒DNA的模板进行PCR扩增 ,均能够获得HA和NA两个目的片段 ;经测序证明两个外源基因在细胞传代过程中没有发生氨基酸水平的改变。动物试验结果表明 ,该重组病毒的毒力在细胞传代过程中没有发生变化 ,接种试验鸡后在鸡体内能够检测到外源基因的存在 ,各免疫组在免疫 2周后的抗体效价平均为 6 5log2 ,完全抵抗了高致病力禽流感病毒的攻击。以上结果表明此重组病毒具有较好的遗传稳定性 ,经过 2 5代的传代后 ,所插入的外源基因及其表达产物的免疫原性未见变化 ,重组病毒的免疫效力相当稳定。     

口蹄疫O/China/99毒株在不同宿主系传代的3A和VP1基因变异研究

利用RT-PCR法扩增了经不同宿主系(乳鼠、BHK21细胞、PK15细胞)连传不同代次的口蹄疫O/China/99毒株的3A和VP1基因,并进行了核苷酸和氨基酸序列分析.结果表明,该毒株经不同宿主系传至90代后,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点也较稳定;而非结构蛋白3A基因却在不同宿主和代次发生突变缺失;经BHK21细胞传代后未发生缺失;经PK15细胞传代,在70～90代之间在第254～313位出现缺失;经乳鼠传代,在60～70代之间在第265～300位发生缺失,并在以后的90代毒中仍在此位缺失.这与代表性猪源流行毒O/YUN/TAW/97和O/HKN/21/70的3A基因在第276～305位发生缺失有相同之处.     

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞,连续传代,检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞,通过连续带毒传代至第7代,病毒滴度可达6.78 lg LD50/mL,并在第10~15代内滴度维持在7.0 lg LD50/mL以上,15~30代滴度稳定在7.0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液,各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)的要求,疫苗效力在6.0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。     

甲肝病毒在人血白细胞中体外连续传代和在分类白细胞中增殖的研究

1985年我们采用间接免疫荧光法(IF法)检测出甲肝患者外周血白细胞中有甲肝抗原(HAAg)存在,继而又将HAAg阳性白细胞直接种入PLC/PRF/5细胞,分离到两株甲肝病毒(HAV)NJ—3株和H—1株。为了弄清白细胞所携带的病毒究竟仅为吸附吞饮,抑或能在其中复制增殖,我们将分离到的HAV用正常人血白细胞进行体外增殖试验,现将结果报告如下。     

百日咳疫苗用菌株基因的遗传稳定性研究

目的对百日咳疫苗(pertussis vaccine)用菌株的主要保护性抗原基因序列的遗传稳定性进行研究,进一步验证此前一代测序的结果,为疫苗的安全性和有效性提供依据。方法采用第二代测序技术(next generation sequencing,NGS)对百日咳疫苗生产用菌株的主代代次(P4)、工作代次(P7)、疫苗代次(P13)及疫苗代次后连续传3代的第3代样品V3代次(P16)的主要抗原基因序列进行测序并分析。采用ELISA和Lowry法对百日咳疫苗生产用菌株各代次主要抗原组分进行抗原含量检测及比活性检测。结果百日咳毒素(pertussis toxin,PT) S1亚基上的8个等位基因氨基酸相对应的24个碱基位点中最高突变率为0.38%,其中疫苗代次最高突变位点(A2789C0.92%)在S5亚基上,其他各代次最高突变位点均不在S亚基上。PT全基因组最高突变率4%,且同一个位点不同代次的碱基突变呈不规律性,突变率没有随传代次数的增加而增高。百日咳黏附素(pertactin,PRN)的24个抗原表位中最高突变率在疫苗代次T951G位点,突变率为1.66%;其他位点的突变率均0.8%。全基因组中突变率最高的位点为V3代次C2025T,突变率为6.24%;各代次PRN全基因组最高突变率6.24%,且不在主要抗原表位区域内;在同一个位点不同代次的碱基突变没有随传代次数的增加而增高,呈不规律性。丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)中B细胞抗原表位区中碱基最高突变率为0.98%(V3代次T6449G位点),其他代次均0.8%;全基因组各代次位点最高突变率为V3代次C7323G,突变率为9.89%;其余代次突变率均9.89%,且不在抗原表位区,同一个位点不同代次的碱基突变没有随传代次数的增加而增高,呈不规律性。PT的ELISA比活性平均值为0.532±0.100,最低限值为0.232。PRN的ELISA比活性平均值为0.885±0.110,最低限值为0.555。FHA的ELISA比活性平均值为0.701±0.170,最低限值为0.191,百日咳菌种抗原含量和比活性较稳定。结论传代过程中PT、PRN、FHA主要碱基位点突变率较低,说明百日咳菌种基因遗传稳定性好。     

长期传代培养人脐带间充质干细胞免疫调节功能的比较

该研究针对不同代次人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)进行系统性比较,探索长期传代培养对其免疫调节功能的影响及可能的机制。hUC-MSCs反复传代培养至P5、P10、P15代,对其分化潜能和表面标志物进行鉴定,β-半乳糖苷酶染色及流式细胞术检测其衰老与凋亡状况。通过不同条件下与人外周血淋巴细胞共培养,比较不同代次hUC-MSCs对淋巴细胞的增殖活性、细胞周期变化及T细胞亚群的调节作用;ELISA检测共培养体系中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6含量。Western blot检测不同代次hUC-MSCs中PD-L1、IDO的表达。结果表明,传代培养至P15代,其干细胞生物学特性无明显改变,但β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著升高。三个代次hUC-MSCs均能调控活化后的淋巴细胞周期,并有效抑制其增殖及Th1/Th17细胞亚群,影响炎症因子的表达,且三个代次间无显著性差异。相对而言,P15代细胞表现出对Treg亚群及IL-1β的调节能力下降。长期传代培养后的hUC-MSCs仍能保持其多向分化潜能和较为满意的免疫调节活性。但不可忽视高代次细胞的衰老对Treg亚群及炎症的调节作用减弱,临床应用中宜采用P10代以内hUC-MSCs以保证治疗的安全性与有效性。     

鸡胚细胞的传代培养和麻疹病毒的增殖

为了建立原代鸡胚细胞的传代培养工艺,探究传代鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性和适应性,本研究将原代鸡胚细胞进行传代培养,分别采用原代鸡胚细胞和传代鸡胚细胞培养麻疹病毒沪-191(Shanghai-191,S-191)株毒种,并对病毒收获液进行滴度检测和基因序列测定。结果显示,原代鸡胚细胞可稳定传代培养至第10代,各代次细胞生长趋势相似;第5代鸡胚细胞染色体检查为正常染色体核型;第8代鸡胚细胞成瘤性检查未见成瘤;采用第3、5代鸡胚细胞制备的麻疹病毒滴度水平高于原代鸡胚细胞,但无显著性差异(n=3,P>0.05),编码病毒核蛋白(nucleoprotein,N)和血凝素蛋白(hemagglutinin,H)的基因序列与S-191株完全一致,未发生变异。本研究证实,原代鸡胚细胞可进行传代培养,各代次鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性不变,产毒水平无显著差异,可用于培养麻疹病毒。     

用人胚肺二倍体细胞株分离一株甲型肝炎病毒

自甲型肝炎患者粪便中分离到一株甲型肝炎病毒(TZ-84)。病毒不产生细胞病变,胞浆中有颗粒性荧光。细胞中的病毒抗原能被抗甲肝病毒抗体阳性血清所中和。 TZ-84株病毒耐酸,耐乙醚。免疫电镜见有大量直径27～30mm的甲肝病毒颗粒,以空心为主。将其接种细胞后的黑暗期随传代而缩短,病毒滴度则随传代而增加。将细胞粉碎后获得的病毒。ELISA滴度为1:16。用其检测45份人血清中抗HAV-IgM抗体,并与Abbott ELISA药盒比较,符合率为91.1％,敏感度为87.1％。     

从海水毛蚶中分离出甲型肝炎病毒

1988年初上海发生甲肝暴发流行,流行病学分析与生食毛蚶有关,本文报道在引起甲肝暴发流行的毛蚶产地江苏启东海域采集毛蚶标本,取腮和消化系统制成40％悬液,用FRhk_4细胞分离甲肝病毒,每代培养21天,连续传二代后经过免疫荧光,ELISA,HAVeDNA斑点杂交试验,免疫电镜等鉴定,5份标本全部阳性,上述结果证实毛蚶中携带甲肝病毒,并为病原学研究提供依据。     

甲型肝炎重组痘苗病毒(VMS11HAV25)的构建及其某些生物学性质

将5′端经过剪切的甲型肝炎病毒全部开放读码框架cDNA连接于痘苗病毒晚期启动子P11下游,重组于痘苗病毒天坛株的HiodⅢM片段Spb Ⅰ位点获得了重组病毒VMS11HAV25。对其生物学性质的研究表明,该重组病毒诱生痘苗抗体的能力、对鸡红细胞的血凝性质、空斑大小及对温度的稳定性等均与原天坛株相同。重要的区别是,重组病毒在家兔皮内和小鼠脑内的毒力都比原天坛株低约1个对数。病毒在人胚肺二倍体细胞连续传15代的表达水平与传代早期者相同。连续传20代后提取病毒DNA做Southern blot杂交表明,甲型肝炎病毒基因仍稳定地存在于原插入位置。     

Comparison of immunological and molecular hybridization detection methods for the detection of hepatitis A virus in sewage

Immune electron microscopy (IEM), radioimmunoassay (RIA) and molecular hybridization with a digoxigenin-labelled cDNA probe were compared for the detection of wild-type human hepatitis A virus (HAV) in raw and treated sewage. In the same experiments, classic tests for culturable enteroviruses were carried out. With the hybridization probes, HAV was detected in three of the 13 amuent samples (23%) and in eight out of 13 effluent samples (61%). For four of the emuent samples, positivity revealed by IEM was confirmed by the cDNA probe. In contrast, two of the samples shown as positive by IEM were negative with the probes. Detection of HAV by RIA was negative in all cases. Demonstration of HAV was higher in emuent than in affluent. No particular relationship was established between demonstration of HAV, on the one hand, and the various concentrations of enteroviruses observed in the same samples on the other. Overall, if all the results, irrespective of the type of water (affluent or effluent), are taken together, 50% of the sewage samples tested were found to contain HAV by one or another method of detection.     

细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测甲肝病毒滴度的研究

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的快速检测甲肝病毒滴度的方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株5'端基因组序列,设计了2条基因特异性引物及一条探针,建立实时荧光RT-PCR法,结合细胞培养检测甲肝病毒滴度,并与ELISA检测法进行比较。结果实验中建立的方法能特异检测甲肝病毒,细胞培养8d检测病毒滴度为lg107.0CCID50/mL。同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大为0.89%,批间样本Ct值变异系数最大为1.66%。建立的细胞培养结合实时荧光RT-PCR法(细胞培养8 d)与细胞培养ELISA法(细胞培养28 d)检测甲肝病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05)。结论该方法具有快速、灵敏、特异等优点,应用于疫苗常规检测有良好前景。     

Duration of viral RNA circulation in blood of patients with hepatitis A

Duration of hepatitis A virus (HAV) RNA circulation in blood of patients with HA was assessed and compared with intensity of cytolytic syndrome. Detection of viral RNA was performed by RT-PCR method with specific primers to VP1/P2A region of HAV genome. 54 blood serum samples from 40 patients were prospectively studied on the presence of HAV RNA. The latterwas detected in 53.7% of serum samples. The greatest number of positive results of HAV RNA detection in blood of the patients with HA was obtained from 8th to 21st day of illness (77.4%). Prolonged viremia (42+/-9 days) was observed in more than 20% of the patients. The maximal time of HAV RNA daetection in blood serum amounted 74 days (period of follow-up). HAV RNA was present in almost all patients with AIAT activity higher than 500 U/l regardless of duration of illness.