CRISPR/Cas基因编辑技术及其在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。其中II型CRISPR/Cas系统已被改造成为一个简便、高效的基因编辑工具,并在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改良中得到广泛应用。简述了CRISPR/Cas系统的结构、作用机理及分类情况,归纳总结了CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母和其他丝状真菌中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行了展望,以期为真菌基因编辑研究提供参考。     

CRISPR/Cas9:基因编辑的新时代

基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点。该文对CRISPR/Cas9系统的结构组成和功能机制,动植物基因靶向编辑和人类在遗传性疾病、病毒感染性疾病以及肿瘤方面进行综述,旨在对CRISPR/Cas9系统的现状和发展进行总结和展望。     

新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1

CRISPR/Cas系统几乎存在于所有的细菌和古菌中,是用来抵御外来病毒和噬菌体入侵的获得性免疫防御机制。2012年起CRISPR/Cas9被改造为基因编辑工具,并衍生出一系列高效、便捷的基因编辑工具,迅速在基础理论、基因诊断和临床治疗等研究领域中得到广泛应用。然而,CRISPR/Cas9也存在细胞毒性、脱靶效应和基因插入困难等一些亟待解决的问题,在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。Cpf1是2015年报道的一种新型CRISPR效应蛋白,具有许多与Cas9不同的特性,有利于克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制。本文综述了近两年来对CRISPR/Cpf1的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

CRISPR/Cas9系统中引导RNA的研究进展

CRISPR/Cas9系统作为重要的一种基因编辑工具,自产生以来广泛应用于各种生物体基因组序列的精确编辑,可在特定位点产生核苷酸的删除、插入或替换,从而改变编码基因的功能。以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术将应用于包括生物育种在内的各项生物技术领域,产生新一代生物技术产品。目前关于CRISPR/Cas9的研究报道多集中于Cas9蛋白的结构功能,以及CRISPR/Cas9系统的工作原理。引导RNA(Guide RNA)作为CRISPR/Cas9系统的重要组分之一,也是基因编辑技术领域的研究热点,近来有多篇文章报道通过改良引导RNA从而提高CRISPR/Cas9的编辑效率和精确性。对CRISPR/Cas9系统中的引导RNA研究进展进行了综述,围绕引导RNA的序列组成、结构特征以及转录产生方式这3方面内容,有助于全面了解CRISPR/Cas9系统的结构特征,讨论了引导RNA对CRISPR/Cas9基因编辑效率的影响,有利于CRISPR/Cas9系统的使用。最后,展望引导RNA今后的研究发展趋势,旨在解决CRISPR/Cas9目前存在的相关问题,优化出效率更高、精度更高的基因编辑技术。     

CRISPR/Cas系统的研究进展及前沿应用

CRISPR/Cas系统作为一种高效的基因组编辑工具,已经被广泛地研究和应用于各个领域。CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/dCas等十多种基因编辑系统;从原来的靶向作用于DNA到现在的除了靶向作用于DNA和RNA外,还能应用于转录调控、DNA循环等无需基因编辑的领域。CRISPR/Cas系统以往存在的诸多局限性正在被一个一个突破,该系统的应用已经进入了一个新的时代。本文对CRISPR/Cas系统近些年的发展情况以及新发现的各种CRISPR/Cas系统做了一个总结,并列举了各个系统最新的应用情况。     

CRISPR/Cas植物基因组编辑技术及其在玉米中的应用*

CRISPR/Cas 系统具有操作简单、效率高等优势,为植物功能基因研究和作物遗传改良提供了重要支撑。介绍了CRISPR/Cas植物基因组编辑技术的研究进展,并对CRISPR/Cas系统及其衍生技术进行了详细比较;结合案例综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在玉米产量、品质、抗逆性改良,以及雄性不育系创制和单倍体诱导等方面的应用;同时针对CRISPR/Cas系统未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望。     

CRISPR/Cas9运输系统的研究进展及其在基因相关疾病方面的应用

CRISPR/Cas9系统是细菌体在长期进化过程中抵御病毒或噬菌体DNA的一种适应性免疫系统。尽管近年来的一些基因编辑技术,如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶等已经给基因编辑带来了许多便利,但CRISPR/Cas9系统以其独特的优势,给基因编辑领域带来了革命性的变化。CRISPR/Cas9系统在生物研究、基因相关疾病的治疗、疾病的基因水平研究等多方面都有广泛的应用。综述近年来CRISPR/Cas9运输系统的研究进展及其在基因缺陷疾病方面取得的应用成果,分析慢病毒和腺相关病毒运载基因编辑元件的利弊,并探讨CRISPR/Cas9系统在基因编辑效率方面的影响因素及仍然存在的问题。     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在糖尿病细胞治疗中的应用研究进展

近几年来,基因编辑技术快速发展,为在特定位置精确操控基因组提供了一个有效而精确的工具。CRISPR/Cas9系统是一种新型的基因编辑工具,可实现对人类基因组的高精度修饰,是疾病建模和治疗的可行选择。随着CRISPR/Cas9系统技术的广泛应用,在糖尿病领域有不少相关研究出现。该文从干细胞分化为β细胞、基因编辑重编程为β细胞以及修饰基因三个方面总结了CRISPR/Cas9技术在糖尿病治疗中的应用。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的人类遗传疾病基因治疗相关研究进展

CRISPR/Cas9系统(常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统)为靶向基因编辑提供了强大的技术手段.利用序列特异性sgRNA的引导,CRISPR/Cas9系统能够精准地在目标DNA的确切位置导入双链切口.与已有的基因编辑手段相比,该系统具有更优异的简便性、特异性和有效性.目前,大量涉及体内外多物种的CRISPR/Cas9基因编辑研究已充分展示了该技术的巨大潜力,为基于该技术的疾病治疗研究和临床应用带来了希望.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术所介导的非同源性末端连接和同源性DNA修复作用,近期多个研究工作已经成功应用该技术修复了包括点突变和基因组缺失等在内的遗传疾病相关基因组缺陷.本综述将总结近期有关利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的相关临床前研究进展.     

URA3基因影响青蒿酸酿酒酵母工程菌中试发酵产量

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于工程酿酒酵母的基因插入、基因替换和基因敲除,通过使用选择标记进行基因编辑具有简单高效的特点。前期利用CRISPR/Cas9系统敲除青蒿酸生产菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 1211半乳糖代谢负调控基因GAL80,获得菌株S. cerevisiae 1211-2,在不添加半乳糖诱导的情况下,青蒿酸摇瓶发酵产量达到了740 mg/L。但在50 L中试发酵实验中,S. cerevisiae 1211-2很难利用对青蒿酸积累起到决定性作用的碳源-乙醇,青蒿酸的产量仅为亲本菌株S.cerevisiae 1211的20%–25%。我们推测因遗传操作所需的筛选标记URA3突变,影响了其生长及青蒿酸产量。随后我们使用重组质粒pML104-KanMx4-u连同90 bp供体DNA成功恢复了URA3基因,获得了工程菌株S. cerevisiae 1211-3。S. cerevisiae 1211-3能够在葡萄糖和乙醇分批补料的发酵罐中正常生长,其青蒿酸产量超过20g/L,与亲本菌株产量相当。研究不但获得了不加半乳糖诱导的青...     

Improved bioethanol production using CRISPR/Cas9 to disrupt the ADH2 gene in <Emphasis Type="Italic">Saccharomyces cerevisiae</Emphasis>

Bioethanol, as a form of renewable and clean energy, has become increasingly important to the energy supply. One major obstacle in ethanol production is developing a high-capacity system. Existing approaches for regulating the ethanol production pathway are relatively insufficient, with nonspecific genetic manipulation. Here, we used CRISPR/Cas9 technology to disrupt the alcohol dehydrogenase (ADH) 2 gene via complete deletion of the gene and introduction of a frameshift mutation in the ADH2 locus. Sequencing demonstrated the accurate knockout of the target gene with 91.4% and near 100% targeting efficiency. We also utilized genome resequencing to validate the mutations in the ADH2 mutants targeted by various single-guide RNAs. This extensive analysis indicated the mutations in the CRISPR/Cas9-engineered strains were homozygous. We applied the engineered Saccharomyces cerevisiae strains for bioethanol production. Results showed that the ethanol yield improved by up to 74.7% compared with the yield obtained using the native strain. This work illustrates the applicability of this highly efficient and specific genome engineering approach to promote the improvement of bioethanol production in S. cerevisiae via metabolic engineering. Importantly, this study is the first report of the disruption of a target gene, ADH2, in S. cerevisiae using CRISPR/Cas9 technology to improve bioethanol yield.     

CRISPR/Cas系统与结核病防控新措施相关性研究

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB,以下简称结核杆菌)感染引起的结核病仍然是严重影响人类健康全球性重大传染病。全球约1/4人口是结核杆菌的潜伏感染者。2019年,世界卫生组织(Worldhealthorganization,WHO)报道全球约150万人死于结核病。深入研究结核杆菌生物学有望为结核病防控提供新工具。成簇规律性间隔短回文重复(Clusteredregularlyinterspacedshort palindromic repeats,CRISPR)/Cas是细菌免疫系统的重要成分,在结核杆菌等分枝杆菌中也广泛存在,同时,也是分枝杆菌基因编辑的重要工具。本文结合课题组研究工作,综述了结核杆菌III-A型CRISPR/Cas系统各组分的生物学功能以及与致病的相关性,CRISPR/Cas编辑工具在诊断治疗耐药结核杆菌和结核病防控新措施中的进展。     

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

基于CRISPR/Cas的分子诊断传感器在非核酸分子诊断中的应用

CRISPR/Cas不仅是一种重要的基因编辑工具,而且还是一种有效的分子诊断工具。目前基于CRISPR/Cas建立了一系列的分子诊断传感器系统,广泛应用于核酸、非核酸等检测过程中。与应用较广泛的核酸分子诊断传感器系统相比,基于CRISPR/Cas的非核酸检测系统目前尚未见系统性综述,因此本文围绕基于CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13建立的两大类非核酸分子传感器诊断系统的基本特征、工作流程及其检测原理等进行了全面综述,期望能为CRISPR/Cas分子诊断系统在体外诊断中的应用提供依据。     

嗜热厌氧杆菌热稳定CRISPR/Cas9基因组编辑技术及在细胞工厂构建中的应用研究进展

嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)来源的菌株作为一个高温发酵的细胞工厂,具有生产生物燃料和化学品的潜力,已引起了研究者的广泛兴趣.随着嗜热厌氧杆菌属来源的多个菌株全基因组测序的完成以及相关的生理生化实验的开展,建立一个简便、快捷的基因操作技术将有助于进一步深入理解和认识嗜热厌氧杆菌有关的代谢途径.最...     

CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术在丝状真菌中的研究进展

CRISPR/Cas9技术是在特定的RNA引导下,利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。自2013年该技术体系建立起来已成功应用于动物、植物及真菌中。本文简述了3种基于核酸酶的基因编辑技术及其应用,概述了CRISPR/Cas9系统的组成及其作用机理,总结了CRISPR/Cas9在模式真菌酿酒酵母及丝状真菌中的应用,并就在丝状真菌中应用该技术时sg RNA表达盒的设计、Cas9表达盒的优化、抗性标记的筛选、受体的选择等方面提出具体的研究方法。另外,针对该技术应用过程中出现的脱靶效应、Cas9核定位信号的添加、启动子的选择及多个靶基因的编辑等问题提出了建议与展望,希望能够为初次涉足该领域的科研人员提供理论参考和技术支持。     

CRISPR/Cas9系统纳米递送及其在肿瘤治疗中应用

新兴的CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现在分子水平上对基因进行操作,具有设计简单、易于操作、特异性好、效率高等优点,广泛应用于肿瘤发生、发展和转移的潜在机制以及临床治疗的研究.利用纳米技术研发的非病毒纳米载体可以将CRISPR/Cas9系统高效递送到体内,为CRISPR/Cas9技术在临床领域的应用提供新途径.本...