噬菌体T7溶菌酶工程菌的构建

将噬菌体T7溶菌酶基因克隆到含有可诱导性启动子LacUV 5的表达载体pARl206中。在没有诱导剂存在情况下,LacUV 5启动子的转录受到抑制。当带有重组质粒的转化菌生长到适当浓度,向培养液中加入0．4mmo1／L IPTG,LacUV 5启动子受到诱导,从而使插入的基因高水平表达,并积累大量具有生物活性的溶菌酶。噬菌体T 7溶菌酶在大肠杆菌中表达的产量平均约22mg／L。     

噬菌体T7溶菌酶基因的克隆

以Pbr322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的Pbr322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶AvaⅡ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到Pbr322及其衍生质粒的BamHⅠ位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3．5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3．8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3．5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10一20％SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳检查噬菌体T7基因3．5蛋白带,结果表明T7基因3．5在Pbr322衍生质粒中的表达优于Pbr322。     

工程菌噬菌体T7溶菌酶的纯化和性质

用崔道珊等构建的噬菌体T7溶菌酶工程菌株,培养物经超声破碎和DE52,CM52柱层析纯化,我们得到电泳纯的T7溶菌酶,分子量为17000,最适反应pH为8.0.其热稳定性欠佳,保温37℃,5min即丧失酶活21%.     

抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白表达载体的构建

目的是构建抗菌肽B(Cecropin B)和人溶菌酶(hLyso)的融合蛋白表达载体。从pUC118～hLyso上卸下人溶菌酶基因后,通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽B基因,并将其融合到人溶菌酶基因的5’端。将抗菌肽B基因和人溶菌酶基因按正确的阅读框架定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a,终止子位于人溶菌酶基因的3’端。PCR鉴定及序列分析表明,所转化的BL21(DE3)菌落中含有插入Cecropin B-hLyso基因的重组质粒pET32a-CB-hLyso。     

大肠杆菌His6融合表达载体及其表达产物的一步变化

构建了Ｔ７启动子控制下的融合表达载体,使外源蛋白以Ｎ端与６个连续的组氨酸残基融合的形式表达。这些载体含有强Ｔ７启动子,终止子,翻译起始区,多克隆位点以及噬菌体ｆ１复制起始区,使外源基因不仅可以得到高效表达而且可以利用ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ包装单链ＤＮＡ,从而不需亚克隆玉可以直接进行测序及点突变。     

PSP94融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗前列腺癌活性分析

在从成年人正常前列腺组织中获得人９４个氨基酸的前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）ｃＤＮＡ基础上,利用ＰＬ表达系统,实现了人ＰＳＰ９４成熟肽Ｎ－末端带有１９个列源氨基酸的融合蛋白在大肠杆菌中的表达。目的蛋白在细胞中主要以包涵体形式存在。表达量约占菌体总蛋白的３０％,分子量约为１６．５ｋＤ。表达产物在人前列腺癌细胞ＰＣ－３上活性分析表明,该融合蛋白能明显抑制前列腺癌细胞的生长。     

禽流感病毒NP蛋白与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达

利用PCR技术扩增禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)NP基因。将NP基因克隆至T4噬菌体表达质粒pSOC的SOC基因(T4噬菌体表面非结构蛋白基因)下游,构建成T4噬菌体SOC位点表达NP的表达载体pSOC-NP。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后表达的目的蛋白SOC-NP进行SDS-PAGE与Western-blot方法检测。结果表明,表达的SOC-NP蛋白相对分子质量约58kD,表达量占菌体总蛋白量的20.34%,并具有与AIV特异性抗体反应的活性。     

T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统

构建了Ｔ７启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统,这些表达载含有强的Ｔ７启动子,翻译起始及终止元件,多克隆位点,线状噬菌体复制起始区等元件,使得该载体就仅可以有效地表达外源基因、还可能利用ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ诱导包装单链噬菌体,从而不需亚克隆就可以进行突变及ＤＮＡ序列测定。     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。     

猴Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

Fertilin是一种异二聚体精子表面蛋白.业已证明,它在精卵反应中起着重要作用.成熟的Fertilinβ亚基的氨基端93肽含有与整联蛋白结合的整联蛋白配体区.该整联蛋白配体区与蛇毒整联蛋白配体区高度同源,它们能与细胞表面的整联蛋白相结合.在此我们报道猴成熟Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆和在大肠杆菌中的表达.用RT-PCR方法获得mmFβNTP93基因,克隆入表达载体pT7-7/hCGβ的EcoRI和BamHI位点,该基因与hCGβ基因一起表达融合蛋白mFβNTP93-hCGβ,Western blotting结果显示,融合蛋白的表观分子量为33kDa,能与抗hCG抗体专一性结合.由于mFβNTP93基因与hCGβ基因相连,因此我们推测,mFβNTP93基因已获得表达.     

噬菌体T7基因6.5和6.7的克隆及其缺失变种的构建

 用适当的限制性内切酶,将噬菌体T7基因6.5和6.7从整个噬菌体T7基因组中分离出来,插入到质粒pBR322中去,转化E.Coli HMS174,筛选出这两个基因的成功克隆。运用同样手段,从整个噬菌体T7基因组中分离出含有部分基因6编码序列,而不含基因6.5和6.7编码序列的T7DNA片段,插入到pBR322的衍生质粒中去,转化Ecoli C1757,再用含有基因6和基因7的双突变噬菌体T7去感染这一转化菌,通过同源交叉而得到缺失基因6.5和6.7的噬菌体T7缺失变种。这种噬菌体只能在载有噬菌体T7基因6.5和6.7,或者只载有基因6.7质粒的寄主中增殖。通过噬菌体结构蛋白电泳分析证明,这种噬菌体丢失了野生型菌体T7所具有的两条结构蛋白带。     

EXPRESSION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN-7 IN Escherichia coli

Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) is a multifunctional cytokine of the transforming growth factor β superfamily, which induces bone formation and plays an important role during bone tissue repair and embryonic development. In this study, human BMP-7 (hBMP-7) cDNA was cloned and expressed in Escherichia coli, and its yield was approximately 30% of the total bacterial protein. After the bacteria were lysed by ultrasonication and repeated washing, inclusion bodies were extracted and dissolved using a high-strength denaturant. The monomer of rhBMP-7 was purified by ion-exchange chromatography, and the purity coefficient was approximately 96%. The protein was renatured with refolding buffers at different pH values. The renatured rhBMP-7 dimer protein in this study increased the alkaline phosphatase activity of NIH3T3 cells. This study may be helpful for the in vitro production and biomedical application of rhBMP-7 protein expressed in an E. coli expression system.     

麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)在痘苗病毒中的表达

将麻疹病毒F和HA基因插入到痘苗病毒中,分别处于痘苗启动子P7.5与P11控制下,获得重组病毒vLmF和vCmH。用抗F多肽抗体和HA单抗进行ELISA检测,结果表明,两株重组病毒均能表达相应的麻疹蛋白。蛋白印迹显示重组病毒表达产物在分子大小,蛋白切割和糖化方面与麻疹病毒糖蛋白一致。两株重组病毒分别免疫家兔都能产生较高滴度的麻疹抗体,这些抗体具有中和作用和血溶抑制作用。此外,vCmH产生的抗体还具有血凝抑制作用。     

嗜水气单胞菌外毒素和外膜蛋白双基因融合表达载体的构建和高效表达

用基因融合方式 ,以嗜水气单胞菌基因组DNA为模板 ,设计引物通过聚合酶链式反应 (PCR)把去除部分毒性活性编码区的细胞毒肠毒素基因 (act)与去除信号肽的外膜蛋白基因 (OmpTS)连接一起 ,两基因之间插入一个link er(Gly4Ser) 3 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,得到 2 .1kb的双基因融合片段 ,克隆于表达质粒pQE 30中 ,构建了双基因重组表达载体pQE30 /act GS ompTS ,转化大肠杆菌M15 (pREP4 ) ,经IPTG诱导 ,表达出预期大小 (81.0kD)的融合蛋白Act GS OmpTS ,此蛋白占菌体总蛋白的 4 2 %。Westernblot检测结果显示 ,该蛋白与抗Act兔血清和抗OmpTS兔血清都呈阳性反应 ,表明融合蛋白保留了外毒素和外膜蛋白的反应原性 ,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据     

One step engineering of T7-expression strains for protein production: increasing the host-range of the T7-expression system

The T7-expression system has been very useful for protein expression in Escherichia coli. However, it is often desirable to over-express proteins in species other than E. coli. Here, we constructed an inducible broad-host-range T7-expression transposon, which allows simple one-step construction of T7-expression strains in various species, providing the option to over-express proteins of interest in a broader host-range. This transposon contains the T7 RNA polymerase driven by the lacUV5 promoter, which is repressed by the lac-repressor. Leaky expression is prevented by the presence of T7-lysozyme on this construct. The complete T7-expression system is flanked by mariner transposon repeats of the suicidal R6Kgammaori plasmid, pBT20-Deltabla. Stable integration of the whole system is possible by a one-step selection for a Flp-excisable Gm(R)-marker. We showed the engineering of E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia carotovora, Salmonella choleraesuis, Agrobacterium tumefaciens, and Chromobacterium violaceum strains with this construct and demonstrated the expression of the Burkholderia pseudomallei Asd protein in these hosts, by induction with isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside (IPTG).     

T4溶菌酶晶体分子堆积的研究

以不对称单位中只有一个分子的１０种不同晶型的Ｔ４溶菌酶晶体为材料,对晶体中的分子堆积进行了研究,结果表明,在溶剂含量较高的晶型中,非极性基团在接触面积中所占的比例略高于溶剂含量较低的晶型,而其极性和带电荷基团在接触面积中所占的比例略低于溶剂含量较低的晶型。溶剂含量较高的晶型多含有晶体学二重轴,二重轴相关的分子间的接触与其他接触相比,含有较少的极性相互作用。这些结果说明溶剂含量的高低可能是由不同结晶