用定位突变方法对人脑己糖激酶活性位点的研究

哺乳动物己糖激酶Ⅰ的分子量是１００ｋＤ．目前已经认为是由分子量５０ｋＤ酵母型己糖激酶通过基因复制和融合进化来的．己糖激酶Ⅰ的Ｃ端半分子包含了底物葡萄糖的结合位点即催化位点．Ｘ射线衍射结构的结果已经推测在酵母型的己糖激酶分子中Ｓｅｒ－１５８、Ａｓｐ－２１１是和葡萄糖的结合及催化活性有关,这些氨基酸残基相当于人脑己糖激酶Ⅰ分子中的Ｓｅｒ－６０３、Ａｓｐ－６５７,它们正好位于该酶分子的Ｃ端半分子中．定位突变这两个氨基酸残基得到４个该酶的Ｃ端半分子酶（ｍｉｎｉ－ＨＫⅠ）的突变体,它们是Ｓｅｒ－６０３→Ｃｙｓ,Ｓｅｒ－６０３→Ｔｈｒ,Ａｓｐ－６７５→Ｇｌｕ,Ａｓｐ－６７５→Ｖａｌ．实验结果指出４个突变体酶的Ｋｍ值变化不大,但酶活性只保留野生型酶的０．２８％～１１％,园二色谱分析４个突变体的ＣＤ谱与野生型酶基本一致,因此说明二级结构没有变化．这些研究结果和Ｘ射线衍射结构的推断是一致的,显示了Ｓｅｒ－６０３和Ａｓｐ－６５７氨基酸残基在该酶结合底物葡萄糖或催化作用上起了重要的作用．     

糖原合成酶激酶-3对τ蛋白磷酸化作用的研究

糖原合成酶激酶 ３（ Ｇ Ｓ Ｋ ３）在 ３０℃与 τ蛋白保温 ４ ｈ 可催化 １７±０４ ｍ ｏｌ磷酸参入 １ ｍ ｏｌτ蛋白 将磷酸化的 τ蛋白经胰蛋白酶消化, Ｆｅ Ｃｌ３ 亲和柱分离及 Ｃ１８反相高压液相层析纯化后,再用高压电泳,手工 Ｅｄｍ ａｎ 降解及自动氨基酸序列分析等检测技术,对其磷酸化位点进行鉴定 结果发现： Ｇ Ｓ Ｋ ３ 可使 τ蛋白 Ｔｈｒ １８１, Ｓｅｒ １８４, Ｓｅｒ ２６２, Ｓｅｒ ３５６ 和 Ｓｅｒ ４００ 发生磷酸化 其中 Ｓｅｒ ２６２ 和 Ｓｅｒ ４００ 为 Ａｌｚｈｅｉｍ ｅｒ 病（ Ａ Ｄ）τ蛋白的异常磷酸化位点根据上述磷酸化作用仅轻度抑制τ蛋白生物学活性,推测： Ａ Ｄ τ蛋白 Ｓｅｒ ２６２ 和 Ｓｅｒ ４００ 的磷酸化可能不是决定其生物功能的关键性位点,单纯 Ｇ Ｓ Ｋ ３ 不能复制 Ａ Ｄ 样 τ蛋白的病理改变      

用蛋白质组学方法研究蛋白质酪氨酸磷酸化

蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式,几乎涉及所有的生理及病理过程,其中酪氨酸残基的磷酸化作为较高级的进化形式和复杂的多细胞生命的特征表现得尤为突出和重要。但目前对酪氨酸磷酸化缺乏大规模和系统性的研究,近年发展起来的蛋白质组学为细胞和组织中的酪氨酸磷酸化蛋白质的系统研究提供了必要的技术。     

双歧杆菌对小鼠肝癌腹水瘤细胞Ca^2＋—ATPase及糖原磷酸化酶a的影响

采用青春型双歧杆菌菌液与小鼠肝癌腹水瘤细胞HCa/16A3-F相互作用,测定其对细胞糖原磷酸化酶a和微粒体Ca^2 -ATPase活性的影响,发现两酶的活性均明显低于对照组,这与细胞内其他一些钙稳态指标的变化相一致。提示双歧杆菌菌液对此腹水瘤钙稳态具有一定的影响,可为双歧杆菌的抗肿瘤作用提供一定的依据。     

酵母PAP1与PHO85激酶复合物对PHO4的磷酸化

酵母ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＡＰ１与其它的ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＨＯ８０、ＰＣＬ１及ＰＣＬ２有较高的同源性。我们上ＰＡＰ１与ＨＡ抗原的融合基因,利用抗－ＨＡ抗体进行免疫沉淀。体外翻译的融合ＨＡ标记肽的ＰＡＰ１与体外翻译的ＰＨＯ８５的免疫共沉淀证明了ＰＡＰ１与ＰＨＯ８５的结合。同时纯化了大肠杆菌表达的ＰＨＯ４蛋白,并构建了Ｐ９ＨＯ８５：：ＰＲＰ１缺失株。ＰＡＰ１与ＨＡ的融合基因被置于酵母ＡＤＨ１启动子的控     

几种植物源化合物对棉铃虫海藻糖酶活性及相关碳水化合物含量的影响

碳水化合物对昆虫的能量代谢和物质合成具有重要的作用。本研究选用2种一般性生物碱（氢溴酸东莨菪碱和烟碱）以及2种β-葡萄糖苷类化合物（七叶灵和皂角苷）, 研究其在不同浓度下对棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)幼虫体内海藻糖酶活性及相关碳水化合物代谢的影响。结果表明: 用饲喂法处理3龄幼虫96 h后, 皂角苷对棉铃虫幼虫的活体抑制效果明显, 且随添加物浓度增高, 棉铃虫死亡率上升, 10, 20, 40 g/L浓度下棉铃虫的均重分别是0.194, 0.089和0.034 g, 分别为对照的86.99%, 39.91%和15.24%。对海藻糖酶活性及其相关代谢酶的测定结果表明, 2种苷类化合物显著抑制中肠海藻糖酶活性, 饲喂40 g/L皂角苷的试虫中肠海藻糖酶比活力仅是对照组的54.21%; 饲喂30 g/L七叶灵的试虫中肠海藻糖酶比活力为对照组的83.73%。而2种生物碱类化合物显著抑制血淋巴和脂肪体中海藻糖酶活性, 20 g/L氢溴酸东莨菪碱对棉铃虫血淋巴和脂肪体组织的海藻糖酶活性抑制率分别为7.24%和71.43%; 而20 g/L烟碱对试虫血淋巴和脂肪体组织的海藻糖酶活性抑制率为26.29%和33.44%。用氢溴酸东莨菪碱、 烟碱和七叶灵处理试虫后, 血淋巴海藻糖含量都有所增高。4种化合物能够导致试虫糖原磷酸化酶活性变化, 其中, 皂角苷在中肠和脂肪体表现为显著抑制作用, 而随外源化合物浓度变化, 糖原含量和糖原磷酸化酶活性表现为此消彼长关系。饲喂4种植物源化合物的试虫血淋巴中葡萄糖浓度变化和其海藻糖变化一致。本研究证明β-葡萄糖苷类化合物是海藻糖酶抑制剂, 在作为先导化合物进行农药创制开发方面具有重要意义。     

糖原合酶激酶-3，一个信号通路的重要调控因子

糖原合酶激酶-3 (glycogen synthase kinase-3,GSK-3) 是一种多功能的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在蛋白质合成、信号传递、细胞增殖、细胞分化、神经功能、肿瘤形成及胚胎发育等众多细胞进程中均扮演重要的角色.GSK-3 能够使多种底物发生磷酸化,并参与胰岛素、Wnt及Hedgehog 等多个信号通路的调控. GSK-3抑制剂在信号通路中能有效地抑制病理情况下GSK-3活性的异常增高,达到治疗的目的.GSK-3的抑制剂将作为一种潜在的药物对治疗糖尿病、阿尔海默茨症、肿瘤等疾病发挥效用.     

脑内糖原磷酸化酶抑制剂对大鼠急性癫痫发作神经炎症及记忆减退的改善作用

目的:探讨脑内糖原磷酸化酶(GP)的抑制剂1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇(DAB)对戊四氮(PTZ)致痫模型大鼠急性发作、神经炎症及记忆减退的改善作用。方法:实验一,将大鼠随机分为2组即Vehicle组(n=5)与PTZ组(n=5),腹腔注射生理盐水或PTZ(70 mg/kg)后30 min,取海马组织,Western blot检测GP表达水平,比色法检测乳酸水平。实验二,将大鼠随机分为4组即Vehicle+Vehicle组(n=18)、DAB+Vehicle组(n=18)、Vehicle+PTZ组(n=19)与DAB+PTZ组(n=18)。侧脑室注射PBS或DAB(50μg/2μl)后15 min,腹腔注射生理盐水或PTZ(70 mg/kg)。行为学与Racine评分评价急性发作程度,Western blot检测海马组织目标蛋白水平,新物体识别记忆测试评价记忆能力。结果:(1)与Vehicle组比较,PTZ组海马组织GP表达水平与乳酸水平均显著升高(P<0.01)。(2)与Vehicle+PTZ组比较,DAB+PTZ组肌阵挛潜伏期、前肢阵挛潜伏期、全身阵挛潜伏期...     

蛋白质可逆磷酸化对花粉管生长的调控作用

花粉管极性生长受多种信号与代谢过程的调控,主要包括Rop GTPase信号途径、磷脂酰肌醇信号通路、Ca²⁺信号途径、肌动蛋白动态变化、囊泡运输、细胞壁重塑等,这些过程都受到蛋白质可逆磷酸化作用的调节。如：(1) Rop调节蛋白(GEF、GDI和GAP)的可逆磷酸化可以改变其活性,从而调节Rop GTPase;同时,蛋白激酶还可能作为Rop下游的效应器分子参与Rop下游信号途径的调节;(2) 蛋白质可逆磷酸化作用既能够激活/失活质膜上的Ca²⁺通道或Ca²⁺泵,又参与调节胞内贮存Ca²⁺的释放,从而调控花粉管尖端Ca²⁺梯度的形成;此外,蛋白激酶还作为Ca²⁺信号的感受器,磷酸化相应的靶蛋白,参与Ca²⁺信号下游途径的调节;(3) 肌动蛋白结合蛋白(ADF和Profilin)的活性也受到蛋白质可逆磷酸化的调节,进而调控肌动蛋白聚合与解聚之间的动态平衡;(4) 蛋白质磷酸化作用调节胞吞/胞吐相关蛋白的活性,并调控质膜的磷脂代谢,从而参与调控囊泡运输过程;(5) 胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和蔗糖合酶的可逆磷酸化可以调节其在花粉管中的功能与分布模式,参与花粉管细胞壁重塑;(6) 转录调节蛋白与真核生物翻译起始因子的可逆磷酸化可以改变其活性,从而调控RNA转录与蛋白质合成。文章主要综述了花粉管生长过程中重要蛋白质的可逆磷酸化作用对上述关键事件的调节。     

去窦弓神经对大鼠脑细胞线粒体氧化磷酸化功能的影响

目的:探讨去窦弓神经对脑细胞线粒体氧化磷酸化功能的影响。方法:用氧电极法及华氏减压法测定线粒体的耗氧量、呼吸控制率(RCR)和二磷酸腺苷/氧比值(ADP/O)。结果:线粒体结构完整性和氧化磷酸化效率明显降低(P0.01),且随时间延长逐渐降低(P0.05或P0.01)。结论:去窦弓神经使脑细胞线粒体的结构和功能遭到一定程度的破坏,且随时间延长日益严重。     

磷脂酰胆碱对兔骨骼肌肌质网钙泵磷酸化微区分子运动的影响

用毫微秒荧光分光光度计研究了精制兔骨骼肌肌质网钙泵的分子内微细结构及周围磷脂对分子内运动状态的影响.磷脂酰胆碱的置换,导致钙泵脂酶体膜微粘度下降,磷脂分子运动增强,膜流动性增加.di(20:4)PC置换基本未改变钙泵分子内磷酸化微区(Domain)的运动状态.短链磷脂置换使钙泵酸化微区运动加速.结果提示,磷脂分子的平均链长是影响钙泵酸化微区运动状态的重要因素;不饱和度对分子内运动几无影响.     

泛素链的体外制备、磷酸化修饰与标记方法

目的 为了制备不同链种类、不同链长及磷酸化修饰的泛素样品。方法 本文主要以生物酶法为手段对以上样品的制备路线进行阐述。制备的主要方法分为两种,一是采用逐次添加的方式达到泛素链延长的目的,二是通过一次酶反应制备混合的多聚泛素链,然后对不同链长的泛素链进行纯化分离。结果 以上两种策略都能达到制备多聚泛素链的目的。进一步,通过对泛素进行磷酸化修饰,制备了磷酸化的泛素样品。通过K11和K48的泛素酶制备了K11/K48分支链泛素。结论 基于以上泛素链的制备路线,可以进一步对不同链接形式的不同亚基进行磷酸化修饰等翻译后修饰,也可以通过在特定亚基进行同位素标记及在特定位点引入小分子探针,进而进行NMR和FRET的测定。综上所述,本方法将为从事泛素信号通路和泛素生化研究的科学家提供借鉴和帮助。     

溴氰菊酯对鸡脑突触膜蛋白磷酸化和Ca—ATP酶活性的影响

研究了神经毒性杀虫剂－溴氰菊酯对体内源性蛋白质磷酸化作用的影响。结果表明,浓度为１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ溴氰菊酯明显抑制正常鸡和经三甲基苯基磷酸酯处理的鸡脑突触膜中５５ｋＤ和６０ｋＤ两种蛋白的磷酸化。     

利用功能基因组学方法研究SMAD去磷酸化-TGF-β超家族信号转导的终止机制

在后生动物机体中,转化生长因子β(TGF-β)及相关生长因子可以通过自分泌、旁分泌及内分泌方式影响广泛的生理活动。它们在多种疾病的发病过程中起着重要的作用,尤其是癌症、纤维化疾病、自免疫疾病和心血管系统疾病。TGF-β受体介导的R-SMADs的磷酸化是TGF-β信号转导通路中最重要的步骤,引起从细胞质内SMAD复合体的组装到核内转录调控这样一个细胞内的信号转导。因此,R-SMADs的去磷酸化是TGF-β信号转导终止的一个重要的机制。最近,我们实验室结合功能基因组学、生物化学和发育生物学的方法,鉴定并研究了磷酸酶PPM1在TGF-β信号转导调控中的功能。文章简短地总结了SMADs动态的磷酸化和去磷酸化是如何调控信号转导的强度和持久性以及TGF-β信号转导的生理功能。     

eIF2α激酶和eIF2α磷酸化对特异的蛋白质合成的激活作用研究进展

eIF2是一种通用的真核翻译因子,它的α亚基在eIF2激酶作用下发生磷酸化修饰后,会引起翻译受阻,从而抑制蛋白质生物合成,近年来,在酵母和哺乳动物中观察到eIF2α磷酸化后,还能特异性激活某种蛋白质的合成,如酵母的GCN4蛋白,哺乳动物的ATF4蛋白。eIF2α磷酸化修饰后具备的特异性蛋白质合成激活作用的机制及其生物学意义,备受人们关注。     

CaMBP-10介导的质膜H~ -ATP酶磷酸化对该酶活性的调节

CaMBP－10在活体处理条件下,抑制IAA诱导的质膜H －ATh酶活性及其磷酸化,抑制作用可被IAA逆转并在外加CaM时被消除,与前期BP－10对IAA生理应答的调节效应相吻合。并且在各项处理中,质膜H -ATh酶活性与其磷酸化水平呈现极显著的正相关。结果表明,质膜H －ATh酶活性受其磷酸化的调节,CaMBP－10参与了这一调节过程,它通过介导该酶磷酸化调节其活性,在IAA应答反应中发挥调节功能。     

磷酸化和乙酰化对FoxO1功能的调节

转录因子FoxO1具有调节肝糖产生、胰岛β细胞功能和脂肪细胞分化等多种生物学作用,其活性主要受磷酸化和去乙酰化的调节,磷酸化可使FoxO1由胞核转位至胞浆,去乙酰化则可增加FoxO1稳定性使其留在核内,但是这两种修饰之间的相     

CaMBP—10介导的质膜H^＋—ATP酶磷酸化对该酶活性的调节

ＣａＭＢＰ－１０在活体处理条件下,抑制ＩＡＡ诱导的质膜Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶活性及其磷酸化,抑制作用可被ＩＡＡ逆转并在外加ＣａＭ时被消除,与前期ＢＰ－１０对ＩＡＡ生理应答的调节效应相吻合。并且在各项处理中,质膜Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶活性与其磷酸化水平呈现极显著的正相关。