双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒

建立一种可同时检测诺如病毒GⅠ和GⅡ型的双重荧光定量一步法RT-PCR方法。应用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,建立双重荧光定量一步法RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并对粪便标本进行检测,以传统RT-PCR方法作为参考评价此方法。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应,对GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达103拷贝/μL,具有很好的重复性。对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。本文建立的双重荧光定量一步RT-PCR法能同时对GI和GII型诺如病毒进行快速检测,其灵敏度高、特异性好,可应用于胃肠炎病人中检测诺如病毒。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.     

棉花黄萎病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

利用棉花黄萎病菌ITS区特异性引物建立了棉花黄萎病菌的实时荧光定量PCR检测方法。利用实时荧光PCR体系,以324 bp的PCR扩增产物构建了标准曲线并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果表明:该方法特异性良好,检测灵敏度为100 copies·μL-1,标准曲线的相关系数为0.994,扩增效率为91.5%。利用建立的检测方法对转基因棉田及常规棉田土壤样本进行检测,结果表明转基因棉田中棉花黄萎病菌数量显著高于常规棉田,与实际观测到的现象一致,也证明了本方法的可行性。因此,本研究建立的棉花黄萎病菌检测方法具有灵敏度高、重复性好等特点,为棉花的种植及病害防治提供了有效的检测手段。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

人偏肺病毒TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人偏肺病毒(hMPV)核酸特异的快速、敏感的TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法.方法:分别设计hMPV特异的引物与荧光标记探针,合成hMPV绝对定量RNA模板,建立实时荧光定量PCR方法,并与常规RT-PCR平行比较,对其灵敏性、特异性和可重复性,以及用于临床样本的适用性等进行评价.结果:本方法可对hMPV进行特异性诊断,检测灵敏度可达10拷贝/25 μL,检测线性范围至少可达10 1～10 6拷贝/反应,且实验重复性好,初步应用于北京地区采集的158份临床鼻咽拭子标本,定量RT-PCR检出31份标本阳性,明显高于常规RT-PCR方法(22/158).结论:建立了人偏肺病毒TaqMan-MGB探针定量RT-PCR检测方法,并初步证实可用于临床鼻咽拭子标本的检测,为开展hMPV的流行监测及临床早期诊断提供了技术手段.     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较

分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价.结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%.上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份.对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性.本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段.     

埃可病毒9型荧光RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测。根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测。该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3~4h。本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断。     

大熊猫轮状病毒PCR检测方法的建立及应用

轮状病毒是威胁大熊猫健康的主要病原微生物之一。为了对大熊猫轮状病毒进行快速、方便且准确地检测,研发适合于基层饲养单位和保护区的检测方法是非常有必要的。本研究通过合成大熊猫轮状病毒Vp7基因序列,构建了PUC-VP7的重组质粒,并将其作为阳性对照对大熊猫轮状病毒样本进行PCR检测和分析。结果表明,在进行PCR扩增分析时,该质粒和病毒cDNA二者均在340 bp处出现了特异性条带。此外,对收集到的45份大熊猫粪便样本进行轮状病毒抗原检测时,其中2份样品在340 bp处出现条带,该基因片段与大熊猫轮状病毒CH-1株的相似性为99.89%。本研究构建的PUC-VP7质粒不但可以作为大熊猫轮状病毒PCR检测中的阳性质控品,而且还能有效地促进该PCR病毒检测技术在基层饲养单位和保护区的推广和应用。     

三种检测婴幼儿腹泻A组轮状病毒的方法学评价

目的对婴幼儿腹泻A组轮状病毒的三种不同检测方法进行评价。方法同时采用胶体金、琼脂糖凝胶电泳、逆转录PCR（RT-PCR）对浙江萧山医院1周320份腹泻患儿的标本进行轮状病毒检测,然后进行方法学比较。结果三种方法的阳性检出率分别为36．3％、48．1％和42．8％,经卡方检验三种方法的检出率之间差异均存在统计学意义（P〈0．05）;以琼脂糖凝胶电泳为检测的最终标准,RT-PCR的敏感性为88．9％,特异性达100％;胶体金法的敏感性71．4％,特异性达96．4％。结论胶体金法检测轮状病毒的敏感性和特异性能够满足临床上对轮状病毒快速筛检的要求;PT-PCR法的敏感性和特异性均最高,既可用于临床检测,又是轮状病毒血清G、基因P分型的重要手段,在对无菌体液和环境样本中轮状病毒的检测具有不可比拟的优势。     

应用实时荧光定量PCR方法定量检测双歧杆菌对Caco-2细胞的黏附

【目的】采用实时荧光定量PCR的方法定量分析黏附于Caco-2细胞的双歧杆菌,并建立一种快速有效分离黏附于细胞的细菌的方法。【方法】采用Triton X-100溶液处理黏附于Caco-2细胞上的菌体,确定获得最佳分离效果的处理时间;建立实时荧光定量PCR定量检测双歧杆菌的方法,获得标准曲线,进行特异性、灵敏度、重复性评价;应用建立的方法分析11株双歧杆菌对Caco-2细胞的黏附能力。【结果】Triton X-100处理黏附于Caco-2细胞的双歧杆菌的最佳作用时间为10 min。实时荧光定量PCR定量检测双歧杆菌的方法重复性好、特异性强、灵敏度高;起始模板浓度范围在104?108 CFU/mL之间具有良好的线形关系,相关系数>99%,在该浓度范围线性方程为：y=?3.345 2x+37.637 0。应用建立的方法定量分析双歧杆菌的黏附能力,与直接镜检法相比差异不显著(P>0.05),检测时间由48 h缩短至4 h。【结论】Triton X-100分离处理结合实时荧光定量PCR方法是一种快速、有效的检测双歧杆菌对Caco-2细胞黏附能力的方法。     

多重RT-PCR用于临床检测三种胃肠炎病毒的研究

轮状病毒、诺瓦克病毒和星状病毒是引起病毒性胃肠炎的主要病原因子。研究采用JV12/JV13、P1/P2和Mon340/Mon348三对引物,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR技术,并应用于128份临床粪便样本的检测,检出轮状病毒62份(48.44%),诺瓦克病毒8份(6.25%),星状病毒11份(8.59%)。在灵敏度试验中,轮状病毒的检测灵敏度为5pg/mL、诺瓦克病毒和星状病毒的检测灵敏度均为50pg/mL。该研究所建立3种常见胃肠炎病毒的多重RT-PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于临床病原诊断和溯源。     

大熊猫生长激素受体(GHR) cDNA 的克隆与序列分析

根据已报道的若干物种GHR 基因cDNA 序列设计引物, 利用RT- PCR 技术首次从大熊猫肝脏组织总RNA中扩增出GHR 基因编码区全长cDNA 序列, 克隆于pGEM®-T 载体后进行测序和序列分析。结果表明,大熊猫GHR 的ORF为1 917 bp , 编码638 个氨基酸的前体蛋白, 由18 个氨基酸的信号肽和620 个氨基酸的成熟肽组成,与人、狗、猪GHR 结构相似, 大熊猫GHR 成熟肽由246 个氨基酸的胞外区、24 个氨基酸的跨膜区和350 个氨基酸的胞内区组成, 并具GHR 的特征性结构。序列相似性比较显示, 大熊猫GHR 与哺乳类GHR 具有69 %～93 %的高序列相似性, 与爬行类和鸟类的序列相似性也达到60 % , 而与鱼类的序列相似性较低, 仅为30 %左右。与其它哺乳动物GHR 相比, 大熊猫GHR 在氨基酸序列上也存在明显的特异性。     

基于双模型融合的大熊猫头部图像分割

在大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的迁地保护和种群饲养管理中,及时、快速地进行个体识别和行为监测,对其健康管理具有至关重要的作用。圈养大熊猫健康状况通常由专门的饲养人员肉眼观测,人力成本高、效率低并且缺乏时效性。基于图像的动物个体识别与行为分析技术效率高、时间成本低,已经成为新的监测发展趋势。已有研究提出,通过大熊猫面部图像的检测和分析,可实现个体识别和行为分类。但该方法依然存在检测精度不足导致识别准确率难以提升的问题。本文提出一种基于YOLOv3和Mask R-CNN的双模型融合方法,实现了大熊猫头部图像分割和精准检测。包含3个部分：YOLOv3完成头部检测,Mask R-CNN完成大熊猫轮廓分割,然后将两个模型的输出进行交并比融合。结果显示,头部检测准确率为82.6%,大熊猫轮廓分割准确率为95.2%,总体头部轮廓分割准确率为87.1%。该方法对大熊猫头部图像的识别率和分割准确率高,为大熊猫的个体识别、性别分类提供了帮助,为行为分析提供了技术参考。     

基于野外痕迹点和GIS技术定量评估步道对大熊猫活动的影响

道路建设不仅直接导致野生动物死亡,还能对栖息地形成阻碍效应,导致小种群出现或隔离,增加物种灭绝的风险。生态学家在道路对野生动物影响研究中的一个重要进展是道路影响域(road-effectzone)的提出,但影响域既不能反映道路影响的变化性,也难以满足栖息地评估对数据的要求。为此,我们以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)为例来探讨道路影响的定量评估方法。在佛坪和长青保护区内选择了3条步道,获取了步道周边1,042个大熊猫的痕迹点数据,通过GIS计算各痕迹点到步道的距离,统计距离步道每20m内的痕迹点数量,以此作为其活动频率。在距步道每100m处设置检测点,通过非参数检验比较检测点前后活动频率分布的变化,寻找道路对大熊猫活动影响的突变点,确定影响变化的阈值距离和评价标准。研究发现在距离步道1,000m内,随距离的增加,大熊猫活动频率逐渐增大,大熊猫有明显的回避效应;在距步道500m、1,000m处发现活动频率发生了显著变化,为影响的阈值距离。本研究基于痕迹点和阈值距离的评估方法可以反映道路影响连续、渐变的特点,使定量、准确评估其影响成为可能。     

集成的专家系统和神经网络应用于大熊猫生境评价

充分了解大熊猫生境的时空格局及其变化,对有效保护大熊猫非常重要.绘制生境图既是野生动物生境评价和监测的一个有效方式,也是一个必要的步骤.新发展起来的人工智能方法(包括专家系统和神经网络方法),在模拟复杂系统过程中能够同时综合定性和定量信息,并可集成于GIS中,有助于大熊猫复杂生境的制图及评价.为了对大熊猫生境进行评价,本文建立了一个较全面的综合制图方法,将专家系统、神经网络和多类型数据全部集成在GIS环境下.结果表明,采用专家系统和神经网络集成方法绘制的大熊猫生境图的精度达到80％以上,高于单一的专家系统方法、神经网络方法和传统的最大似然法制图的精度.Z统计方法也证实了新建立的专家系统和神经网络集成方法要显著好于3种单一方法.     

Immuno-PCR法诊断早期梅毒的方法学建立及其应用

目的建立Immuno-PCR法诊断早期梅毒的方法学,评价其灵敏度、特异性、重复性及其临床应用。方法利用基因重组TpN47抗原免疫新西兰兔,制备抗体并用Weston blotting检测;利用抗TpN47抗体作为捕获抗体与血清中TpN47抗原结合,通过链霉亲和素、生物素化抗体、生物素化DNA和PCR扩增等建立Immuno-PCR法检测梅毒螺旋体抗原TpN47体系;评价该方法的灵敏度、特异性和重复性;收集200例临床标本通过Immuno-PCR法、ELISA、TPPA和TURST法进行临床应用比较。结果 Weston blotting结果显示TpN47抗体阳性;Immuno-PCR比ELISA法敏感性强103倍,比TPPA、TURST强105倍;特异性高,重复性好。临床标本中Immuno-PCR法敏感性和特异性分别为86.00%（P〈0.05）和100.00%,ELISA法为71.00%和98.00%,TPPA法为65.00%和100.00%,TRUST法为68.00%和95.00%。结论 Immuno-PCR法检测梅毒螺旋体TpN47抗原敏感性高,特异性强,重复性好,可作为梅毒螺旋体感染的早期诊断方法 。     

HS-SPME-GC / MS 在大熊猫尿液化学成分检测中的应用

尿液在大熊猫化学通讯过程中具有重要作用。对大熊猫尿液中化学成分的检测是揭示大熊猫尿液中化学物质组成及其功能的关键。本实验通过使用顶空固相微萃取技术(Headspace-solid phase microextraction,HSSPME)对大熊猫尿液样品进行前期处理,继而利用气相色谱- 质谱联用技术(Gas chromatography-mass spectrometry,GC / MS)对大熊猫尿液中化学成分进行检测。共检测到56 个峰,通过在NIST (National Institute of Standards
and Technology)质谱库中进行检索,初步推定出其中的38 种物质。除此之外,还对HS - SPME 萃取头的净化方法进行了探索和改进。结果表明,顶空固相微萃取技术结合气相色谱- 质谱联用技术能够应用于大熊猫尿液中挥发性与半挥发性化合物的检测,并且能够得到较好的实验结果,为揭示大熊猫化学通讯机理提供基础。