亚硝酸诱变导致枯草杆菌中L-丙氨酸脱氢酶对L-谷氨酸脱氢酶的转换 Ⅱ.L-谷氨酸脱氢酶阳性变种中L-丙氨酸脱氢酶的诱导形成

枯草杆菌B.subtilis IRC-3-N-1,GDH~+变种在营养培养基上生长时能产生ADH。这样合成的ADH是誘导性貭的。誘导物除了酶的底物,L-丙氨酸外,尚有DL-天門冬氨酸,DL-苏氨酸,D-丙氨酸与丙酮酸。将酶进行純化时,GDH与誘导性的ADH始終同时存在于每一步驟中,而且两者的比例不变。誘导性的ADH与野生型细菌的本貭性ADH在电泳移动率上沒有区別。由于ADH誘导形成时,并末观察到变种細胞內GDH的相应減少,同时抑制了ADH的誘导合成,并不引起GDH水平的变化,因之由后者直接轉变成前者的可能性并不存在。所有GDH~+变种,包括自亚硝酸誘发突变或自发突变来源的,都能誘导生成ADH。从以上这些試驗結果,以及以前关于ADH与GDH免疫学試驗的結果,作者們认为枯草杆菌中,由亚硝酸誘发突变而引起ADH轉換成GDH的原因是由于与ADH合成有关的調节基因发生突变的結果。     

亚硝酸诱变导致枯草杆菌中L-丙氨酸脱氢酶对L-谷氨酸脱氢酶的转换——Ⅲ.野生型中有与GDH抗原性上类似的蛋白质的存在

由枯草杆菌野生型菌株的ADH制剂所制备的抗ADH抗血清能中和ADH与GDH。免疫电泳试验的结果指出抗ADH抗血清中含有二个抗体;一为抗ADH抗体,另一为抗GDH抗体。在野生型细菌的无细胞抽出液中亦找到了与GDⅡ在抗原性上近似的蛋白质即GDH-ORM。5株不同来源的野生型细菌,细胞内仅有ADH而没有GDH活力,但均有GDH-CRM的存在。葡萄糖能促进GDH~+型变种的GDH的合成,同时也促进野生型细菌的GDH-CRM的合成。但是葡萄糖对GDH合成的促进作用要比其对GDH-ORM的作用显著得多。作者对野生型细菌的CRM与变种中GDH的形成的遗传学关系进行了讨论。张景六同志参加技术工作;在制备抗血清过程中,承上海生物制品研究所协助,谨此致谢。     

[α]甘油磷酸氧化酶系的組成部份

(一) 在經徹底冲洗的兔骨骼肌製劑中,[L-α]甘油磷酸和琥珀酸的氧化彼此干涉。琥珀酸對[L-α]甘油磷酸氧化的抑制作用能因加入抑制琥珀酸脫氫酶的焦磷酸而解除。 (二) 當用細胞色素c作受體時[L-α]甘油磷酸,還原輔酶I和琥珀酸三者同時氧化時總氧化速度僅相當其中氧化速度最高者即還原輔酶I單獨氧化的速度。[L-α]甘油磷酸氧化酶系也因[2,3]二氫硫基丙醇的處理而失效。 (三) 當用[2,6]二氯酚靛酚作受體時[L-α]甘油磷酸和琥珀酸同時氧化時速度完全等於二底料單獨氧化時速度的和。[L-α]甘油磷酸的氧化不受苯代氨甲酸乙酯的影響。 (四) 本文結果說明[L-α]甘油磷酸的氧化不通過細胞色素b而通過中間因子和細胞色素c連接。     

链霉菌的菸酰胺核苷酸酶

发現鏈霉菌的細胞抽出液能够抑制以NAD或NADP作为受氫体的脫氫酶的反应系統中还原型輔酶的形成。实驗証明,这种抑制作用的原因是細胞抽出液中存在有菸酰胺核苷酸酶,它能迅速地水解菸酰胺輔酶,而使脫氫酶无法表現其活力。这一发現足以解析为什么在鏈霉菌的抽出液中一直不能測出各种脫氫酶的活力来。鏈霉菌的菸酰胺核苷酸酶与已知各种来自动物或微生物的菸酰胺核苷酸酶不同,鏈霉菌中酶的特点是: (1)經純化以后,酶制剂中仍含有核酸。(2)对某些蛋白貭变性剂与对热非常稳定,在除去酶制剂中的DNA以后,其对热稳定性即行降低;向已去核酸的酶中加入核酸或其分解产物,可以使其对热稳定性恢复、甚至超过原来的水平。(3)在pH5.5—9.0之間,酶活力相等,但在去除酶制剂中的核酸以后,出現了酶活力的最适pH值。     

日本血吸虫琥珀酸氧化酶的研究

应用測压法和分光光度法証明了日本血吸虫含有琥珀酸氧化酶,琥珀酸脫氫酶,琥珀酸-細胞色素c还原酶和細胞色素氧化酶等完整系統。血吸虫的琥珀酸氧化酶活力与細胞色素c浓度有关,浓度增加,酶活力上升,在0.4×10~(-5)—2×10~(-5)M之間与酶活力成直綫关系。酶活力与磷酸盐浓度亦有一定关系,浓度愈低,酶活力愈強。在酶作用的最适条件下(琥珀酸鈉,0.02M;細胞色素c,2×10~(-5)M;磷酸盐緩冲液,0.01M,pH7.4)測定合抱成虫匀浆的酶活力,結果为:氧耗量Qo_2=30.3微升/小时/毫克氮量;琥珀酸耗量Q_S=322微克/小时/毫克氮量;延胡索酸产生量Q_F=157微克/小时/毫克氮量。当雌雄虫分別測定时,在等氮量基础上,雌虫酶活力比雄虫高。丙二酸鈉,二乙基二硫代氨基甲酸鈉(銅試剂)和氰化物都能強烈地抑制琥珀酸氧化酶活力。治疗血吸虫病常用的几种銻剂在2×10~(-3)M时,体外試驗,对此酶活力无明显的抑制作用。此外,氰化物除抑制細胞色素氧化酶外,还能抑制琥珀酸脫氫酶(用甲烯蓝方法測定)。与細胞色素c相似,維生素K_3亦能刺激匀浆的呼吸。此外,我們发現了日本血吸虫匀浆經过加热处理后,可以分离出一种耐热的“还原物貭”,对細胞色素c有化学的还原作用。本文还討論了血吸虫琥珀酸的代謝途径和細胞色素系統在呼吸鏈中可能占有重要地位。     

地衣芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和特性

克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)谷氨酸脱氢酶基因(gdhA), 并研究其表达和功能. 发现野生型IRC-3 GDH-菌株和突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因都能互补大肠杆菌谷氨酸缺陷型菌Q100 GDH-的缺陷性状, 但突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因不能互补野生型IRC-3 GDH-菌株的谷氨酸缺陷性状. 经测序发现两者的核苷酸序列完全一致. gdhA基因在野生型IRC-3和突变型IRC-8中都能正常表达, 在野生型IRC-3细胞中未发现有抑制GDH活性的物质存在. 推测由于GDH翻译后调节的差异导致GDH表型的不同. 根据序列分析, 地衣芽孢杆菌GDH属于六聚体GDH中的家族Ⅰ, 而枯草芽孢杆菌GDH则属于家族Ⅱ, 两者间亲缘关系相距甚远.     

肝脏的生理功能(续)

二.肝的代谢功能在肝內,碳水化合物、脂肪以及蛋白貭的代謝是交錯进行的。这方面的知識,在一般生物化学教科书內均有所闡述。这里仅就肝在代謝作用的調节方面和肝脏机能障碍时对有机体的代謝影响加以介紹。肝和腎对全身的細胞起着重要的調节作用,因为这两种器官可以决定細胞外液成分的恆定。細胞外液为細胞营养所必不可缺少的,肝可以稳定細胞外液內的有机組成成分。通过肝的储存、合成、結合、排泄以及发放有机成分,肝可以稳定細胞外的介貭,而使身体的正常功能得以进行。例如血糖浓度的恆定以及从血循环中移去氨基酸或加入氨基酸等作用,都表現出肝的作用可以使全身細胞的营养得以保証稳定。 內环境恆定的自动調节作用可以由神經的及体液的因素加以維持。这些因素都可以調节肝細胞的代謝活动。一部分的自动調节机制是由于肝能激活或抑制一定的激素而引起的。     

橘黴素抗生作用之機構 Ⅱ.對於幾種酶系的影響

前文曾報道橘黴素能抑制動物組織和細菌的細胞呼吸。這些結果易使人猜想到此種抗生素可能作用於細胞中存在的酶或酶系。事實上已有人實驗證明橘黴素能抑制金色葡萄球菌的乳酸脫氫酶和微生物的異咯嗪色素酶(flavine enzymes)。現在存在的問題是:橘黴素是否對於其他的酶類,特別是其他呼吸酶類也有顯著作用?是否對於酶都有毒性     

輔酶細胞色素還原酶系的研究——Ⅰ.還原輔酶Ⅰ与琥珀酸的同時氧化

(一)本報告提供了一個從輔酶Ⅰ,用酶還原法製備還原輔酶Ⅰ的方法。我們所製得的還原輔酶Ⅰ鈉鹽乾粉,可以在低温保存數月而不被氧化。 (二)與心肌製劑中顆粒相結合的輔酶Ⅰ細胞色素還原酶系,和用乙醇抽出的水溶性的輔酶Ⅰ細胞色素還原酶的性質頗不相同。其中比較重要的不同點是對於細胞色素c的親力,前者遠大於後者,其米氏常數僅約為後者的十二分之一。 (三)用一心肌顆粒製劑作為材料,無論用氧或過量之細胞色素c作為氫受體,還原輔酶Ⅰ與琥珀酸同時氧化時的總速度,不等於二者分別氧化時速度之和,而僅等於其中氧化較快者單獨氧化時之速度。但如用[2,6]二氯靛酚作為氫受體時,二者共同氧化時之總速度完全等於二者分別氧化時速度的和。 (四)當用氧或過量之細胞色素c作為氫受體時,琥珀酸與還原輔酶Ⅰ能彼此互相抑制對方氧化的速度。有足夠的實驗材料說明,還原輔酶Ⅰ對於琥珀酸氧化的抑制,不是由於草醯乙酸聚集的緣故。 (五)如果在反應混合物中同時含有琥珀酸脫氫酶的專一抑制劑,丙二酸,則琥珀酸對於還原輔酶Ⅰ氧化作用的抑制即被解除。 (六)根據以上的實驗結果,可以認為,還原輔酶Ⅰ及琥珀酸先通過一個共同的因子與細胞色素c作用。這個共同的因子在一般情形之下,也是這兩個酶系統的速度限制因子。應該指出在我們的實驗中,並未使用任何可能影響酶系統結構的條件,因此我們的結果是在一個比較接近於生理狀態的情形之下獲得的。 (七)應該着重指出,從本報告的結果可以看到,一個用人為的方法從複雜酶系上溶解下來的酶的性質,有時並不能代表這個酶在有組織的酶系統中的真實情况。 (八)我們相信,本報告所說明的兩酶系競爭一個共同因子的一些現象,將为研究複雜酶系之間的相互關係,提供一個新的方法。     

还原辅脱氢酶Ⅱ的氧化问题

利用自动記录白金微氧电极定氧与分光光度計测定的方法,发現大白鼠肝脏微粒体能氧化NADPH。微粒体的NADPH氧化系統活力不受氰化物、双香豆素、2,4二硝基酚、5乙,5(?)戊巴比妥酸鈉与迭氮酸鈉等所抑制。鼠肝匀浆經45,000×g离心所得的上清液不能催化NADPH被氧气所氧化。但含有对双香豆素高度敏感的还原菸酰胺核苷酸脫氫酶,其性貭与Ernster所提出的“DT黃递酶”很相似。微粒体制剂中加入上清液后NADPH氧化系統活力增大約1倍左右。此时若加入双香豆素,則NADPH氧化系統总活力被抑制大約一半。我們认为上清液中对双香豆素敏感的还原菸酰胺核苷酸脫氫酶能通过某种与微罫宓牧到M成NADPH氧化系統。这样NADPH就可以不需通过线粒体氧化。我們认为在鼠肝中NADPH的氧化途径如下: →还原性生物合成NADPH—?→通过綫粒体氧化(包括通过轉氫酶的作用) →微粒体NADPH氧化系統→O_2 →还原菸酰胺核苷酸脫氫酶→微粒体上未知系統(可能和微粒体上NADPH氧化系統部分相同) →O_2     

肝癌癌变机制的生化研究:喂偶氮染料对大鼠肝癌酶活性的影响

在3'-MeDAB誘发的肝癌組織中,G-6-PD、6-PGD、二肽酶的活性都較正常肝高,而另一些酶如GDH、GMA、OCT、TP、TD、TTA的活性則較正常肝低或甚至測不出来。大多数酶活性都在癌前期即有明显的变化,其变化情况多趋向于癌的特征,如肝癌組織中活性較高的酶,在引癌过程中其活性較对照組有升高趋势,如G-6-PD、6-PGD、二肽酶(以甘氨酰甘氨酸为底物);肝癌組織中活性降低的酶,在引癌过程中其活性有降低趋势,如GDH、GMA、OCT。但以丙氨酰甘氨酸为底物的二肽酶活性的变化則与对照組基本相似。癌前期TP及TTA活性較对照組都无明显差异。肝癌組織中GSSGR活性与正常肝相似,但在引癌过程中(4—13周)則有升高趋势。苏氨酸去水酶受基础食料中营养因素的影响較大,癌前期看不出3'-MeDAB对它的影响。非致癌物,2-MeDAB,除了使GDH活性升高外,对上述其他酶活性都无明显的影响。肝癌綫粒体內GMA和GDH比活性都較对照組及正常肝綫粒体为低。癌前期肝綫粒体GMA比活性較对照組显著降低,而GDH比活性則无明显改变。根据本实驗及其他实驗室結果,我們认为:3'-MeDAB所引起的肝脏酶活性变化,可能是由于它在肝內进行代謝引起G-6-P旁路代謝的活跃,以及3'-MeDAB代謝产物通过各种不同机制对酶的影响所致。这些酶活性的变化可能导致肝細胞的异常生长和异常分化因而形成肝癌(图12)。非致癌物,2-MeDAB,可能与3'-MeDAB的代謝途径不同,因而产生不同的影响,而3'-MeDAB所产生的特殊影响則可能与其致癌作用有关。     

浑球红假单胞菌氨同化途径的研究

本文测定了浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株601谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和丙氨酸脱氢酶(ADH)的活性。低氨时,GS/GOGAT活力高,GDH活力低,高氨时,GS/GOGAT活力低,GDH活力高。在以分子氮或低浓度氨为氮源的培养条件下,加入GS抑制刑MSX(L—methionine—DL—sulphoximine),细菌生长受到抑制。但是,生长在以谷氨酸为氮源的细菌则不受影响。上述结果表明,浑球红假单胞菌菌株601氨同化是通过GS/GOGAT途径和GDH途径。     

艾氏腹水肿瘤Crabtree效应的研究

我們利用同位素C~(14)-标記甘氨酸参入蛋白貭的作用研究艾氏腹水肿瘤細胞中的Crabtree效应,观察由氧化作用释放出的能量被利用的情况。实驗結果說明艾氏腹水肿瘤細胞的呼吸效能是有效的,由琥珀酸氧化供应的能量可以支持旺盛的蛋白貭生物合成。說明由氧化磷酸化作用生成的ATP可以透到綫粒体外以供应蛋白貭生物合成的需要。若在加入琥珀酸同时加入葡萄糖或2-脫氧葡萄糖而引起Crabtree效应后,肿瘤細胞的呼吸略有降低,但是C~(14)标記甘氨酸参入蛋白貭的速度却比单独加入琥珀酸时要小得多,而仅接近单独加入葡萄糖时的参入速度,我們认为这可能是由于在引起Crabtree效应的条件下产生了线粒体中ATP局部化的緣故。     

氧化磷酸化作用的研究 Ⅱ.2,4-二硝基苯酚对琥珀酸氧化抑制效应的解除

进一步研究DNP对大白鼠肝脏綫粒体琥珀酸氧化的激活和抑制,发現当琥珀酸氧化已被DNP抑制时琥珀酸脫氫酶并沒有受到明显的抑制。DNP对琥珀酸氧化的抑制可以被α-酮戊二酸、(?)柠檬酸、柠檬酸、丙酮酸、β-羟基丁酸等解除。α-酮戊二酸的解除作用与底物水平磷酸化作用无关,但与脫氫过程有密切关系;当加入0.2mM亚砷酸鈉时,α-酮戊二酸不再能使呼吸恢复。谷氨酸解除DNP对琥珀酸氧化抑制的作用不受天門冬氨酸α-酮戊二酸轉氨酶的抑制剂环絲氨酸的影响,Amytal使呼吸恢复的作用与线粒体內源底物含量有关?疚慕Y果进一步說明琥珀酸氧化需要能量激活,我們认为某些底物脫氫生成的NADH可以通过琥珀酸氧化引起NAD~+需能还原的逆反应生成高能磷酸化合物因而激活了琥珀酸的氧化。通过这样的途径生成高能磷酸化合物可能是对DNP較不敏感的。     

细菌把L-山梨糖醇氧化成为L-果糖

美国Nabisco Brands公司R.O.Horwath认为,L-果糖本是作为种饮料中的甜味剂使用的,也可以供糖尿病患者食用的,但由于L-糖类不被代谢,不产生后味,所以他们从一种荧光假单胞菌(Preudomonas fluorescens)的突变株中分离出L-伊地醇脱氢酶,用这种酶来氧化L-山梨糖醇,生产L-果糖。把L-阿拉伯糖缩合,形成L-葡     

积累L-苹果酸的米根霉突变株酶活性初探

对富马酸产生菌株—米根霉ME-F10进行诱变育种的过程中, 得到一株性能稳定的高效积累L-苹果酸的突变株ME-M15。该菌株发酵96 h平均L-苹果酸产量达16.3 g/L, 较出发菌株L-苹果酸积累量平均提高3倍, 而富马酸和乙醇的积累量大幅下降。对突变株代谢途径关键酶活研究表明, 突变株富马酸酶胞质途径同功酶和乙醇脱氢酶活力较之出发菌株酶活力明显减弱, 而丙酮酸羧化酶活力无明显差别。     

酵母细胞色素c的纯製及其酶性质的研究

(一)我們利用陽離子交換劑吸附一次的簡單方法可以大量製備酵母細胞色素c,其產量為240毫克/千克乾酵母。 (二)用上法初步純製的酵母細胞色素c,在pH 6.3的電泳場內分成兩個有色部分,都具有細胞色素c的性質。利用硫酸銨部分沉澱法,可分出電泳均一的合量較多的一部分——酵母細胞色素c甲。兩部分細胞色素c對牛心琥珀酸氧化酶系和輔酶Ⅰ細胞色素c還原酶系的作用相同。 (三)電泳均一的酵母細胞色素c甲的合鐵量為0.43％,在還原狀態時在550 mμ的克分子消光係數為2.81×10~4。酵母正鐵和亞鐵細胞色素c甲230—600 mμ的吸收光譜和合鐵量0.43％的牛心細胞色素c的光譜很相像。 (四)酵母細胞色素c甲對哺乳類動物心肌酶系的影響,在琥珀酸氧化酶系及輔酶Ⅰ細胞色素c還原酶系中其活力比哺乳類動物本身細胞色素c的活力為高。酵母亞鐵細胞色素c和哺乳類動物心肌亞鐵細胞色素c在哺乳類動物心肌細胞色素氧化酶系中氧化速度的差別不大。 (五)酵母細胞色素c甲能變成猪心肌肉的“內源”細胞色素c。由此製得之心肌製劑其琥珀酸氧化酶系的活力比猪心肌製劑的該酶系活力要大。     

白地霉的戊糖代谢——Ⅰ.木糖代谢的初步变化途径

(1)用在木糖上培养的白地霉2.361无細胞提取液进行了木糖代謝酶体系的研究。查明木糖代謝的初步变化途径如下: D-木糖 TPNH H~ →木糖还原酶←木糖醇 TPN~ (1) 木糖醇 DPN~ →木糖醇脫氫酶←D-木酮糖 DPNH H~ (2) D-木酮糖 ATP→D-木酮糖激酶D-木酮糖-5-磷酸(3) (2)催化式(1)的酶为木糖还原酶,需要TPN。用紙层析法鉴定木糖还原的产物为木糖醇。(3)催化式(2)的酶称木糖醇脫氫酶,需DPN。(4)催化式(3)的酶为D-木酮糖激酶,所試过的其他戊糖在同样条件下均不被磷酸化。(5)白地霉无細胞提取液中测不出木糖(?)构酶的活力。排除了这一途径的可能性。(6)催化式(1)(2)(3)各反应的酶均有适应形成的特性,符合Stanier的連續适应学說。     

QscR基因的调控对菌株M.sp.SDM11产L-丝氨酸的影响

M.sp.SDM11是一株能以甲醇为唯一碳源生长的细菌,初步发酵检测发现能转化甘氨酸为L-丝氨酸。QscR基因产物是甲基营养菌中丝氨酸循环的一个转录调控关键因子,根据在GenBank中已报道的QscR基因序列(登录号:NC_012988.1)设计引物,以M.sp.SDM11的染色体DNA为模板,利用PCR扩增得到一大小为987 bp的QscR基因,将该基因克隆到广泛宿主载体pLAFR3上,在帮助质粒pRK2013的介导下,利用三亲本结合使其导入到菌株SDM11中构建重组菌株SDM12。对SDM12进一步研究发现,重组菌株中与L-丝氨酸合成相关的关键酶丝氨酸羟甲基还原酶(SHMT)的酶活比野生型菌株SDM11要低,约为野生型菌株的70%左右,另一个酶——羟基丙酮酸还原酶(HPR)的酶活力也只有野生型的75%。进一步将菌株进行产L-丝氨酸研究,结果表明,重组菌的产L-丝氨酸能力也明显降低,约为野生型菌株的67%左右。     

刺激膈下迷走神经外周端对血浆自由脂肪酸浓度的影响

本工作主要用兎做急性实驗,用强直感应电流刺激腹侧和背侧膈下迷走神經外周端,观察血浆自由脂肪酸濃度的变化,結果如下: (一)兎在麻醉情况下不进行刺激时,血浆自由脂肪酸濃度是比較稳定的;刺激膈下迷走神經后,血浆自由脂肪酸濃度卽显著升高;注射阿托品后,此反应卽消失。这說明兴奋迷走神經有使血浆自由脂肪酸濃度升高的作用。 (二)切除两侧腎上腺后刺激膈下迷走神經,血浆自由脂肪酸濃度仍表現明显的升高;而当切除胰腺后,此反应卽消失。这說明兴奋迷走神經所引起的血浆自由脂肪酸濃度的增高性变化,主要是通过胰腺而实現的。 (三)为了探討胰腺中那一因素与上述現象的产生有关,曾以注射氯化钴以及四氧嘧啶方法分別破坏胰島α和β細胞。初步結果指出,破坏α細胞后,再刺激膈下迷走神經,血浆自由脂肪酸濃度仍表現升高反应;而当破坏β細胞后,此反应卽基本消失。又結扎胰导管16—23天后,在胰腺腺泡細胞萎縮的基础上,刺激膈下迷走神經,血浆自由脂肪酸濃度不仅不表現升高,反呈明显下降。总結以上結果,可以认为:兴奋迷走神經可通过对于胰腺(可能与胰島β細胞以及胰腺外分泌系統有关)的作用明显地增高血浆自由脂肪酸的水平,这对于进一步闡明在正常机体中脂类代謝的神經体液性調节机制,似有重要的意义。