大肠杆菌噬菌体T4基因42和43DNA片段无性繁殖系的鉴定和分析

含胞嘧啶的T4 DNA用核酸内切酶Eco RI、Sal Ⅰ、和Hind Ⅲ切割,特别是用Eco RI不完全切割,所得片段以质粒pBR 322作载体,在大肠杆菌E.coli KH 802菌株中进行了无性繁殖。5,000个无性繁殖系经标记获救法作遗传鉴定,筛选基因42和43的无性繁殖系,并对其所带T4 DNA片段的图位和有关基因的功能表达进行了初步分析。试验证明,10个无性繁殖系带有基因43片段,其中CC-20还带有全部imm基因及基因42;基因43内B22和B263突变位点之间有一个Eco RI酶切位点,基因42或imm内也有一个酶切位点,无性繁     

大肠杆菌T4噬菌体DNA连接酶基因(G30)在无性繁殖系细胞中的表达

从T₄基因30的无性繁殖系细胞中,用一般提取T4 DNA连接酶的方法,分离纯化得到与T₄ DNA连接酶相同的酶。无论从它在DEAE-纤维素和磷酸纤维素柱上的层析行为,或从用T₄ DNA连接酶酶活标准测定法测定结果,都说明它与T₄ DNA连接酶是相同的,这就表明T4DNA连接酶基因(即基因30)在无性繁殖系的大肠杆菌细胞中已被表达。     

β-溶血性链球菌的苏氨酸基因在大肠杆菌中的无性繁殖和表达

用限制性内切酶BamHI分别酶解β-溶血性链球菌染色体DNA和pBR322质粒DNA,经T4DNA连接酶连接后转化到受体菌大肠杆菌C600,采用插入钝化法筛选含β-溶血性链球菌DNA片段的Ap~rTc~s无性繁殖系,然后利用受体细胞从营养缺陷型转变为原养型的遗传学功能互补选择方法筛选到含苏氨酸基因的57-5号菌。对57-5号菌进行营养标记和抗药性标记测定,证实它带有苏氨酸基因。通过琼脂糖凝胶电泳分析和电子显微镜观察进一步证实57-5号菌所含的杂种质粒pFD201 DNA是由β-溶血性链球菌DNA和pBR322 DNA重组而成。     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质体

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质体pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hin d Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K 12 HB 101(recA~- r_k~- m_k~-)为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质体。利用环丝氨酸浓缩Ap~rT_c~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120个无性繁殖系为Ap~rT_c~3。随机挑出3株含有重组质体的无性繁殖系进行大肠杆菌素     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质粒

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质粒pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hind Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K12HB101(recA~-r(?)m(?))为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质粒。利用环丝氨酸浓缩Ap~rTc~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120株无性繁殖系为Ap~rTc~s。随机挑出3株含有重组质粒的无性繁殖系进行大肠杆菌素El(colicin El)免疫特性测定及显微镜观察,证明为大肠杆菌素El敏感,并为典型的大肠杆菌形态。随机挑出一株含有重组质粒pAG-5的无性繁殖系,采用Zasloff等酸酚法进行重组质粒DNA提取,用Hind Ⅲ消化重组质粒DNA后进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察到重组质粒pAG-5除pBR322质粒DNA带外含有λ-Hind Ⅲ的第5 DNA带。用重组质粒DNA再次对HB101(recA~-r(?)m(?))及K12 802(Su_(11)~+m_K~+)受体进行转化,转化体在含氨苄青霉素培养基平皿上生长,但在含四环素培养基平皿上不生长,再次证明为Ap~rTc~5.每微克重组质粒DNA Ap~r转化体为4.0—4.6×10~3。     

质粒pBR322的缺失突变株

质粒pBR322[]是较理想的基因载体之一, 在基因工程研究中已经取得了不少突出的成 绩［u]。我们在体外建造pBR322质粒DNA与 X DNA片段的重组质粒过程中,获得一个质粒 pBR3 2 2的缺失突变株,命名为pH A4。这种 突变株对于研究质粒DNA的形成、进化和结 构都具有一定的意义。     

Ti质粒T区基因4的分离及其在高等植物中的表达

根癌农杆菌Ti质粒的T区DNA上带有致瘤基因,其基因4编码细胞分裂素合成酶。以pGV 354(pBR 322质粒中插有Ti质粒C 58 T区DNA的HindⅢ15-HindⅢ22大片段)重组质粒出发,我们分离了基因4,并通过基因载体pGV 3850引入了高等植物。结果证明基因4能促使烟草、向日葵,石刁柏等转化组织分化长芽。DNA分子杂交表明,转化的烟草中有正常植物所没有的基因4同源片段存在。     

蓖麻蚕(Attacus ricini)核糖体RNA基因片段在大肠杆菌中的无性繁殖

利用质粒pBR322作运载体,获得了蓖麻蚕(Attacus ricini)核糖体rRNA 基因(rDNA)的部分片段在E.coli 中的无性繁殖株。酶切图谱分析及Southern 法分子杂交鉴定证明,重组质粒pARI 含有1.95MdrDNA EcoRI-BamHI 双酶切片段;pARⅡ含有2.6Md 的rDNABamHI片段。并测定了BamHI 片段与pBR322连接方向。     

蓖麻蚕(Attacus ricini)核糖体RNA基因片段在大肠杆菌中的无性繁殖

利用质粒pBR322作运载体,获得了蓖麻蚕(Attacus ricini)核糖体rRNA基因(rDNA)的部分片段在E.coli中的无性繁殖株。酶切图谱分析及Southern法分子杂交鉴定证明,重组质粒pARI含有1.95MdrDNA EcoRI-BamHⅠ双酶切片段;pARⅡ含有2.6Md的rDNABamHⅠ片段。并测定了BamHⅠ片段与pBR322连接方向。     

转座子Tn233(CH)中抗性基因的定位

将Tn233(CH)从质粒DR233转座到可以扩增的质粒pBR322上,并绘制了包括7种限制性内切酶切点的pBR322:: Tn233(CH)DNA的限制图。经限制类型分析表明,链霉素抗性基因位于H3片段上,磺胺抗性基因位于H4片段上,汞盐抗性基因位于H1片段上。另外,B3片段上同时带有链霉素与磺胺的抗性基因,B1片段上带有汞盐抗性基因。     

转座子Tn233(CH)缺失突变株特性的研究

将带有质粒pBR322::Tn233(CH)(抗药类型为Ap~rTc~rSm~rSu~rHg~r)的大肠杆菌C600ML(多聚酶Ⅰ温度敏感突变株)在非允许温度条件下培养时,分离到12株营养缺陷突变型,其中10株的抗药类型为Sm~rSu~rHg~r,经质粒DNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析表明,除1株(突变型3号)仍有质粒DNA外,其它9株细胞中的质粒DNA已不复存在。在12株中另外2株的抗药类型为sm~rSu~r(突变型19号与41号),它们也仍旧带有质粒DNA,经质粒抽提与限制性内切酶分析表明,这3种质粒(分别称为pTD3,pTD19与pTD41)DNA分别比pBR322::Tn233(CH)少了一些相邻的限制片段,经计算,pTD3缺失了1.33kb,pTD19缺失了7.22kb,pTD41缺失了9.09kb。从质粒的遗传图上可以看出,这3株缺失质粒都保留了pBR322载体上的DNA复制点与Tn233(CH)上的转座基因(TnpA),但是Tn233(CH)与pBR322相连处的两个末端反向重复顺序中的一个已经缺失,实验表明它们可能都失去了转座功能。对这些自发产生的缺失变种在转座子演化上的意义进行了讨论。     

质粒pBR322在recA基因缺陷的大肠杆菌细胞内的遗传重组

使用琼脂糖凝胶电泳、DNA限制性内切酶水解以及电子显微镜等分析手段,证明在两株recA~-的大肠杆菌质粒pBR322转化子中,pBR 322 DNA的多倍周长环形寡聚物被大量合成。这个事实说明质粒pBR322 DNA在大肠杆菌细胞中的遗传重组似有独立于rec A基因的途径。本文介绍一个改进的大肠杆菌“清亮裂解液”制备法。按照这个方法制备的细菌清亮裂解液可排除染色体DNA的污染。     

蚕豆叶绿体DNA BamH I克隆库的构建及含16S-25S rRNA基因克隆的分析

蚕豆叶绿体DNA(ct—DNA)经BamH I酶切产生26个片段,最大的为14．00kb,最小的为0．42kb。本文以pBR322为载体,E．Coli HB101为受体菌,采用标准分子克隆法构建了蚕豆ct—DNA BamH I克隆库,并从库中分离得到含叶绿体rRNA基因的克隆。32P标记的E．Coil 16S、23S rRNA能和蚕豆ct—DNA BamH I第6(B₆,5．65kb)和第9(B₉,4．70kb)个片段杂交,含有这二个片段的克隆分别命名为pVFB32和pVFBl6。利用几种限制性内切酶酶切和Southern印迹法构建了pVFBl6的物理图谱。pVFBl6电镜下观察到有一变性环(A—T丰富区),经Hind I酶切,电镜观察定位此A—T丰富区位于16S和23S rRNA基因的间隔顺序内,推测该环可能与DNA复制有关。     

pGV3850载体系统的改进研究

位于pGA 472上nos-npt的基因片段,经Hind III/Sal I双酶完全消化,克隆到pBR332的Hind III/Sal I位点,将这一重组DNA转化E. coli HB101,在和R64 drd11的mob功能和tra功能的帮助下,经重组后带有卡那霉素抗性基因的pBR322可以进入浓杆菌中,并经同源重组整合到农杆菌质粒pGV3850的T-DNA区。这样得到的是一个改良的pGV3850系统。他除了具有pGV3850系统原有特点之外,还具有一个新的特点：在中间载体pBR322上带有Km^r标记基因,这就为能克隆到pBR322上的任何不带有标记的基因提供标记,便于转化后的筛选。     

Gap-Repair方式建立一种基于pBR322-Red的新型重组工程系统

应用Gap—Repair新技术,以pBR322为载体,在λ噬菌体Red重组酶的作用下,通过同源重组直接从大肠杆菌DY330染色体上亚克隆了长度为6．7kb的包含Red重组酶基因的λ噬菌体左向操纵子基因序列。建立了一种能够随意在不同细菌宿主中转移的基于pBR322-Red的重组工程系统。为了验证pBR322-Red的生物功能,以大肠杆菌染色体上的galk基因为靶标,用Red介导的单链DNA重组技术敲入T→G单碱基突变,使galk基因内编码第145位氨基酸的密码子由TAT转变成TAG,产生了一个琥珀突变。确定了pBR322-Red系统的重组功能。     

大肠杆菌cosmid质粒的分离和DNA构型

Bolivar等u]于1977年用人工重组技术从ColEl质粒构建出声pBR322质粒,由于pBR322质粒带有两个抗药性标记,有多拷贝以及多种限制性内切酶单一切点等特性,近年来已被广泛用作重组DNA实验的载体。Collins等^[2]用pBR3222质粒与λ charon 4A的带有Cos位点的EcoRI酶切片段重组,进一步得到cosmid质粒,cosmid质拉除了具有pBR322质粒原来的优点外,它能够携带更大的外源DNA片段(40Kb),能够像λ charon 4A一样在体外进行包装,从而提高转化率。     

噬菌体T7溶菌酶基因的克隆

以Pbr322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的Pbr322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶AvaⅡ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到Pbr322及其衍生质粒的BamHⅠ位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3．5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3．8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3．5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10一20％SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳检查噬菌体T7基因3．5蛋白带,结果表明T7基因3．5在Pbr322衍生质粒中的表达优于Pbr322。     

杂种质粒pTW161和pTW162的构建及其性质

由pBR322和pTW16两种质粒DNA构建成了两种杂种质粒pTW161和pTW162。质粒pTW16来源于一种抗钴的克氏产气菌,带有抗钴的基因。pTW161和pTW162两种杂种质粒的区别仅在于pBR322和pTW16 DNA重组连接的方向不同,两种质粒均为Ap~rCo~r,但pTW162抗钴能力比pTW161弱。     

带有sop基因稳定表达载体的构建

F质粒的第五个EcoRⅠ片段mini-F具有质粒的分配功能。其EcoRⅠ-BamHⅠ片段含有oriS、ccd、repD和sop基因(sopA,B和C)。该片段与pBR322重组,得到质粒pDMC32。pDMC32经SmaⅠ酶切,T4连接酶连接,得到衍生质粒pDMC311,消除了oriS、ccd和repD片段。MI32(pDMC32)和MI311(pDMC311),在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率分别为93％和100％。而对照MIR322(pBR322)培养55代时,质粒保持率仅为10％。带有色氨酸启动子质粒pDR720与pBR322重组,得到质粒pDMC40。pDMC40再与mini-F的sop基因重组,得到带有sop基因的稳定表达质粒pDMC48。MI48(pDMC48)在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率为100％。     

噬菌体T4脱氧胞苷酸羟甲基化酶基因与免疫基因在大肠杆菌“极大细胞”中的表达

本文用“极大细胞”的方法研究噬菌体T4脱氧胞苷酸羟甲基化酶基因(基因42)与免疫基因(基因imm)的表达。从无性繁殖系CC20中提取带有噬菌体T4基因42和基因imm的重组质粒pHC20,转化到大肠杆菌CSR603(recA~-、uvrA~-、phr-1~-)中。转化于经紫外光照射后继续培养,使细胞在染色体降解的同时扩增了质粒DNA。用~(35)S标记质粒编码的蛋白质,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影鉴别噬菌体T4基因42与imm的产物,其分子量分别为25,500和38,500道尔顿。实验结果表明噬菌体T4基因42与imm在大肠杆菌“极大细胞”中表达。在一定条件下,“极大细胞”是研究基因表达的一个比较方便的体系。