大肠杆菌中的蛋白质分泌

目前,在微生物遗传工程中应用的表达载体大多是指导目的基因在宿主的胞质中表达,尽管外源蛋白的产量可达菌体总蛋白的50％以上,但同时也存在不少缺点:(1)高水平表达的外源蛋白容易发生沉降、凝聚,难以重新折叠为正确构象,不易获得有功能的产品;(2)产品纯化工艺复杂;(3)对宿主有毒性作用,导致表达体系不稳定;(4)外源蛋白易被胞内蛋白酶降解。这使得微生物遗传工程的应用受到很大限制。 如果能使在胞质表达的外源蛋白分泌到胞外,既可纠正由子高表达所引起的种种不利。近十年开展了对E.coli中蛋白质定位的深入研究。E.coli的蛋白质最初都是在胞质合成的,通过分泌而定位于膜或周质。例如外膜蛋白A(OmpA)先以前体形式在胞质合成,然后借助信号肽的作用穿过内膜,在分泌过程中信号肽被切除成的成熟蛋白定位子外膜。现在许多作者利用E.coli分泌蛋白的信号肽序列与目的基因相融合,将外源蛋白分泌出胞质。如用碱性磷酸酶(phoA)的信号肽分泌人α干扰素,使产物的稳定性和产量都有所提高,并且可通过简单的物理技术得到产品。E.coli溶血素通过特殊的分泌机制穿越细胞膜分泌至培养基,现已尝试用该系统构建表达载体。 本文从信号肽的作用、成熟蛋白对分泌的影响、宿主在分泌中的作用、E.coli溶血素的分泌以及外源蛋白在E.coli中的分泌等几方面综述近几年研究E.coli蛋白质分泌的进展。     

十字花科黑腐病菌分泌蛋白质双向电泳条件的构建及优化

本研究旨在建立一套适合于十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris 8004,Xcc8004)分泌蛋白质的双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE),以便更好的利用蛋白质组学技术鉴定Xcc 8004的分泌蛋白质。我们就MME和XCM2两种培养基对分泌蛋白质的诱导能力、蛋白质提取方法以及样品上样量等方面对2-DE的影响进行了比较,结果表明,XCM2培养基对Xcc 8004分泌蛋白质的诱导能力比MME强。用TCA/丙酮法沉淀蛋白质得到的双向电泳图谱背景清晰,分辨率高。分别采用400μg、300μg、250μg和150μg四个不同的上样量进行双向电泳,结果显示在上样量为250~300μg时(IPG p H 3-10,24 cm),电泳图谱分辨率最好。综上可知,XCM2培养基比较适合用于Xcc 8004分泌蛋白质的诱导,TCA/丙酮法提取分泌蛋白质为较优方法,250~300μg是较为合适的上样量。     

蛋白质分泌信息与基因工程

蛋白质分泌信息存在于自身氨基酸排列顺序内,上溯到DNA分子中。信号顺序引发蛋白质分泌的早期过程,成熟蛋白顺序决定最终分泌结果。它们相互作用并离不开细胞输出环境的配合。信号顺序启发人们对分泌性载体的构建,对蛋白质分泌信息的全面了解,肯定了基因工程中全方位研究的必要。     

叶绿体蛋白质组研究进展

亚细胞蛋白质组学是近年来蛋白组学研究中的一个热点。通过细胞器的纯化和亚细胞组分的分离,降低了样品的复杂性,增大了相应蛋白质组分的富集,有利于由此分离获得的蛋白质的序列分析及功能鉴定。叶绿体蛋白质组为植物亚细胞蛋白质组学研究中相对全面的一部分,利用亚细胞分离结合双向电泳技术系统地鉴定叶绿体中蛋白质组分是获取叶绿体蛋白质信息、确定其功能的重要技术手段。本文就近年来植物叶绿体蛋白质组涵盖的叶绿体内、外被膜、叶绿体基质、类囊体膜和类囊体腔蛋白的研究进行综述,以全面认识叶绿体蛋白的组成、特点及其在叶绿体生理生化代谢网络中的作用。     

闽楠叶片响应干旱胁迫的蛋白质组分析

闽楠对土壤水分要求较高,为了提高闽楠造林的成活率,该研究以正常供水为对照,测定了不同干旱胁迫时间(7d、14d)及复水后7d的叶片蛋白质组及生理生化指标变化,以探讨闽楠响应干旱胁迫的分子生理机制。结果表明:(1)不同干旱胁迫处理下闽楠叶片蛋白质双向电泳(2-DE)分析结果共发现51个差异表达蛋白;采用MALDI-TOF/TOF成功鉴定到45个蛋白点;这些鉴定出的差异蛋白与光合作用、碳水化合物和能量代谢、胁迫响应与防御、翻译后修饰、蛋白质转换与分子伴侣功能等生理代谢过程密切相关。(2)检测不同干旱处理时间闽楠叶片膜脂过氧化相关MDA含量,防御相关酶SOD、CAT、POD活性和糖代谢相关酶PFK、AGPase、PK及PDH活性,发现各指标在14d持续干旱胁迫时主要呈下降趋势,且变化均达到极显著水平(P0.01)。研究认为,持续干旱胁迫下,光合作用和植物防御系统以及能量和糖代谢的降低是闽楠不耐干旱的重要生理生化原因,研究结果为今后耐旱闽楠的分子育种提供了理论依据。     

适于小麦叶片蛋白质组分析的样品提取方法研究

以‘铭贤169'小麦苗期叶片为材料,分别采用传统的TCA/丙酮沉淀法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法以及改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取叶片总蛋白,进行双向电泳分离和胶体考染,以建立适用于小麦蛋白质组分析的样品制备方法.结果表明:TCA/丙酮沉淀法较酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法获得的蛋白杂质较少,在二维电泳图谱中的蛋白点较酚抽提-甲醇/醋酸铵沉淀法提取的蛋白点清晰且多.相比于以上2种提取蛋白样品方法,改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取的小麦叶片蛋白杂质少、二维电泳图谱上的点明显增多、分辨率较高.所选小麦的代表性蛋白点能获得成功鉴定.该方法可推广应用于水稻叶片蛋白质组分析的样品提取.     

N+注入引起向日葵蛋白质组变异研究初报

低能离子注入可以引起生物DNA分子结构的变异,但用蛋白质组学方法对低能离子注入后所引起的蛋白质诱变效应的研究尚缺乏文献报道。以向日葵种子为实验材料,对N 注入后种子的蛋白质组进行了初步分析,共获得369个蛋白质点,其中包括对照种子中的8个特异点和处理种子中的4个特异点。这些特异点的分子量在15～34ku之间。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定发现对照种子蛋白质中的No.29特异蛋白与MADS盒转录因子HAM59有23．48％的匹配率。处理种子中的No．279特异蛋白与亮氨酸拉链蛋白的同源蛋白HAHB-4有23.20％的匹配率。     

温敏核不育水稻花药蛋白质组初步分析

采用固相pH梯度 SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对温敏核不育水稻 96 4 2S可育与不育条件下减数分裂期花药总蛋白进行了分离 ,通过银染显色 ,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱 .PDQuest 2DE图像分析软件可识别约 10 0 0个蛋白质点 .蛋白质点在 2D胶上的重复性为 :沿等电聚焦方向偏差为 1 4 5± 0 2 3mm(n =8) ,沿SDS PAGE方向偏差为 :1 15± 0 17mm(n =8) .对两种育性不同样品的 2D胶上部分共有的蛋白质点 ,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (matrixassistedlaserdesorption ionizationtimeofflightmassspctrometry ,MALDI TOF MS)进行了肽质谱指纹图分析 .通过采用PeptIdent软件对SWISS PROT数据库的查询 ,有 5 0个蛋白质点在数据库得到归属鉴定 .对育性不同的2种样品 2D较上明显差异的蛋白质点进行了分析鉴定 .在不育变化为可育的过程中 ,明显表达上调的蛋白质点包括几丁质酶 ,酸性磷酸酶 ,胞浆激酶 ,谷蛋白前体 ,以及ESTSC72 61蛋白 ,明显下调的蛋白质包括β expansin前体 ,谷氨酸氨甲酰转移酶和 1种未知功能的蛋白质     

运用免疫蛋白质组学方法筛选羊种布鲁氏菌免疫反应性蛋白

布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体,能引起人类慢性感染,造成家畜流产和不孕.在不同种布鲁氏菌中,羊种布鲁氏菌毒力最强,在中国布鲁氏菌病流行中占主导地位.目前,还没有安全的用于预防人类布鲁氏菌感染的疫苗.用于预防家畜布鲁氏菌感染的弱毒活疫苗产生的抗体能够干扰对免疫动物感染布鲁氏菌野毒的诊断,从而对根除布鲁氏菌病的计划实施有负面影响.然而,羊种布鲁氏菌免疫蛋白质谱目前还不完善.为了研制更安全、有效且能区分野毒感染的疫苗,本研究应用免疫蛋白质组学技术筛选羊种布鲁氏菌疫苗株M5的免疫反应性蛋白.经二维电泳结合免疫杂交技术筛选到88个具有免疫反应性的蛋白质点,后经质谱鉴定其归属于61个蛋白,包括许多新的免疫反应性蛋白,如延伸因子G,F0F1ATP合成酶亚单位？？,OMP1.本研究为布鲁氏菌病疫苗研制提供了许多免疫反应性候选蛋白.     

双向电泳结合质谱初步分析蛇岛蝮蛇毒蛋白质组

采用荧光染料(Cy5)标记中国辽宁蛇岛蝮(Gloydius shedaoensis shedaoensis,GSS)蛇毒(snake venom,SV,GSS-SV)蛋白质,获得了该蛇毒的双向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D SDS-PAGE)图谱,经DeCyder软件分析,分辨出1000多个蛋白点,分子量范围在10～150ku间,等电点在4～7的蛋白质点占78.8%。凝胶后染色(post-staining)采用蛋白荧光染料Deep Purple,选取的5个蛋白点经胶内酶解,产生的肽段经高效液相色谱-电喷雾串联质谱(high performance liquid chromatography/HPLC-electro-spray ionization tandem mass spectrometry/ESI-MS/MS,HPLC-ESI-MS/MS)进行序列测定,质谱数据经Sequest Bioworks软件分析,为蛇毒L-氨基酸氧化酶、金属蛋白酶、类凝血酶、纤溶酶原激活物和磷脂酶A2的同源蛋白。本研究采用的荧光标记2DSDS-PAGE结合HPLC-ESI-MS/MS的技术适于高通量研究蛇毒蛋白组成。     

非编码小RNA BSR0602在布鲁菌环境适应能力中的调控作用

BSR0602是位于布鲁菌染色体上的非编码小RNA,在前期研究中我们发现,BSR0602与布鲁菌的胞内生存能力相关.为了进一步研究BSR0602对布鲁菌胞内环境适应能力的调控作用,采用双向电泳技术对布鲁菌野生株16M和BSR0602过表达株的全菌蛋白质谱进行比较分析.结果显示,BSR0602过表达后,布鲁菌转运代谢蛋白和压力适应蛋白的表达发生变化. qRT-PCR和HIS表位标记实验结果进一步证实,BSR0602在转录和翻译水平均影响氧压力适应蛋白SodA的表达.相关表型实验结果显示,BSR0602过表达株对氧压力更为敏感,证实了BSR0602在布鲁菌适应氧压力中的作用.结果表明,非编码小RNA BSR0602作为布鲁菌的转录后调控因子,可通过调控压力适应蛋白的表达来影响布鲁菌的压力适应能力和胞内生存.     

蛋白质组学在植物逆境胁迫研究中的进展

蛋白质组学是后基因组时代研究的热点领域之一,自从蛋白质组这个概念被提出以来,其研究一直受到广泛关注,其研究技术也有了极大地进步。植物时刻都面临各种非生物胁迫,包括干旱、冷、盐、金属等,在长期进化过程中,植物形成独特的机制来响应逆境,然而目前对于植物如何适应逆境的分子机制尚未完全阐明。因此蛋白质组学作为一种强有力的研究技术手段,将为研究植物响应胁迫的分子机制提供理论支撑。介绍了蛋白质组学的产生背景、研究技术手段及植物在各种胁迫条件下的蛋白质组学研究、植物亚细胞器的蛋白质组学研究状况,同时对植物蛋白质组学的发展前景进行了展望。     

红海榄根部盐胁迫反应的比较蛋白质组学分析

红海榄(Rhizophora stylosa)是一种典型的红树林盐生植物.本研究利用蛋白组学技术对淡栽(R0)和3% NaCl盐栽(R3)处理后的红海榄根部总蛋白进行了比较研究.双向电泳图谱的结果表明,R0和R3分别有981和972个蛋白点,蛋白点主要集中在分子量28～70 kD,等电点4.0～8.5之间. R0和R3之间差异明显的有15个蛋白点.其中,8个蛋白的表达量在R0中表达增高（10倍）,而在R3中相对下降.另外,7个蛋白的表达量在R0中较低,而在R3中表达量显著增高.对这15个蛋白点进行肽质量指纹图谱分析,10个蛋白点找到匹配蛋白.功能预测分析发现,在盐水栽培上调的蛋白质一般与逆境胁迫有关,淡水栽培上调的蛋白质一般与基本代谢有关.这些研究结果为进一步研究红海榄的耐盐机理提供了有意义的线索.     

小鼠晶体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究

目的应用双向电泳和质谱技术研究5周龄小鼠晶体蛋白质组。方法提取小鼠晶体总蛋白,进行固相pH梯度（IPG）等电聚焦双向电泳,胶体考马斯亮蓝R-250染色,使用PDQuest7．30图像分析软件分析电泳图像。选择主要蛋白点胶上酶解,应用基质辅助激光解析电离飞行时间／飞行时间（MALDI—TOF／TOF）仪器进行串联质谱（MS／MS）鉴定。结果上样量为882μg和190μg时,分别检测370±41蛋白点（n=3）和57±5个蛋白点（n=3）。高上样量能够较好地分离晶体低丰度蛋白,如念珠状纤维结构蛋白BFSP;低上样量可很好地分离高丰度蛋白-晶体蛋白（包括αA、αB;βA1～βA4;βB1～βB3;γA～γF和γS等）。质谱鉴定得到1种细胞骨架蛋白和16种高丰度晶体蛋白。结论双向电泳和质谱技术有效考察了晶体总蛋白质,为分析白内障形成过程中蛋白质的表达改变提供了新的方法和途径。     

禾谷镰刀菌基因组中含寄主靶向模体分泌蛋白功能的初步分析

基于生物信息学的方法,以SignalP v3.0、TargetP v1.01、Big-PI Predictor和TMHMM v2.0四个分析软件对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)全基因组的11 640个蛋白编码基因的N-端氨基酸序列进行信号肽分析,预测出606个潜在的分泌蛋白编码基因.通过对这些潜在的分泌蛋白进行MEME软件分析,发现其中有157个分泌蛋白的剪切点下游120氨基酸残基范围内具有一个保守的RXLX模体,其中有79个分泌蛋白具有可预测的功能性描述,包括FG00023.1具有与草酸盐氧化酶1有关的功能,FG01588.1具有与1,4-α-葡糖苷酶葡聚糖有关的功能,这些基因可作为禾谷镰刀菌致病相关的候选基因.其中FG04097.1编码的具有与丝氨酸型蛋白酶有关的功能在致病疫霉和疟原虫真核寄生物中具有相似保守的寄主靶标模体的效应蛋白中也观察到,但FG09127.1,FG05287.1编码的蛋白尚未被证明参与致病过程的研究报道.深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制.利用禾谷镰刀菌基因组学研究成果,结合计算机技术和生物信息学的方法,分析其分泌蛋白组学,将有助于全面掌握其致病因子的结构与功能.对于这些蛋白功能的比较研究,将有利于对禾谷镰刀菌致病性的分子机制的探索,并为设计新的防治措施提供理论依据.     

大肠埃希氏杆菌UTI89分泌蛋白组的预测分析

目的：从大肠埃希氏杆菌UTI89基因组中筛选出全部潜在的分泌蛋白并进行初步研究。方法：使用SignalP3.0、TatP1.0、 SecretomeP2.0等蛋白分析软件对5211个ORF进行预测;对筛选出的信号肽及分泌蛋白的基本特征进行统计学分析;使用Blast 2 Sequences进行同源性分析。结果：共筛选出432个sec途径分泌蛋白,19个Tat途径分泌蛋白,386个非经典分泌蛋白;信号肽、分泌蛋白平均长度分别为25.5aa、282.8aa;信号肽中出现频率最高的3种氨基酸依次为L、A、S;仅有两个信号肽的氨基酸序列完全相同,相应的分泌蛋白高度同源。结论：大肠埃希氏杆菌UTI89基因组中有837个ORF可能编码分泌蛋白;分泌蛋白集中在500aa以下;组成信号肽的氨基酸相对保守,多数为疏水氨基酸;信号肽变异性较大,含相同信号肽的蛋白可能由同源基因编码。     

表皮生长因子受体调控的人鼻咽癌细胞系CNE2分泌蛋白质的筛选

为筛选表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)调控的鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)细胞的分泌蛋白质,揭示EGFR在NPC发病中的作用机制,采用无血清培养法培养NPC细胞系CNE2,并用转化生长因子(transforminggrowthfactor-α,TGF-α)刺激CNE2细胞24h作为实验组,对照组CNE2细胞不用TGF-α刺激.超滤法脱盐并浓缩两组细胞的培养上清制备分泌蛋白,采用双向凝胶电泳技术(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)分离两组细胞的分泌蛋白,PDquest图像分析软件识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白.建立了实验组和对照组CNE2细胞分泌蛋白的2-DE图谱,图像分析识别了22个差异蛋白质点,质谱鉴定了8个非冗余蛋白质,其功能涉及肿瘤细胞侵袭转移、细胞凋亡和增殖,为进一步揭示EGFR在NPC发病中的作用及其机制奠定了基础.     

蛋白质组研究中的分析技术

蛋白质组分析技术已在生物科学各领域被广泛应用,蛋白质组的研究已成为目前国际上的前沿和研究热点。概述了蛋白质组研究中的常用分析技术,包括样品制备、双向凝胶电泳、凝胶图像分析、质谱鉴定及数据库检索等。直观地列出了蛋白质组研究的技术体系流程图。各种分析技术的连用和分析过程的自动化将是蛋白质组研究技术的发展方向。