mRNA差别显示技术的研究进展

ｍＲＮＡ差别显示是继ｍＲＮＡ差减杂交技术之后又一种显示ｍＲＮＡ差异表达的新方法。它通过ＰＣＲ随机引物与锚定引物的合理搭配,在特定ＰＣＲ条件下,展示不同条件下真核细胞ｍＲＮＡ的差异扩增片断,为寻找未知基因提供了新途径。     

发展中的mRNA差别显示技术

随着ＰＣＲ技术的出现（１９８５）,在分子生物学界又相继出现了两个很有影响的新技术──ＲＡＰＤ技术（１９９０）和ｍＲＮＡ差示法（１９９２）,前者用于分子标记,后者用于基因分离。ｍＲＮＡ差示法的生物学基础是基因的差别表达,既：单个细胞中表达的基因仅占基因总数的１５％。这种基因的差别表达决定了生命的所有过程,如：发育和分化、对逆境的反应、细胞分裂、老化等,图一给出了该方法最初的技术路线。提取要比较的两种或两种以上样品的ｍＲＮＡｓ,分别逆转录成ｃＤＮＡｓ,经过ＰＣＲ扩增后,直接进行测序胶电泳即可识别有差别的ｍＲＮＡ。其中、关键的是ＰＣＲ扩增时两个引物的设计．３＇端引物Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ＭＮ很容易与具有Ｎ＇Ｍ＇－ｐｏｌｙ（Ａ）－３＇末端的大多数ｍＲＮＡ结合,进行ｃＤＮＡ的逆转录合成。Ｍ、Ｎ提供锚定位点,防止３＇端引物在ｐｏｌｙ（Ａ）序列不同位置上的随机结合。５＇端为１０个碱基的随机引物。这个经验上的碱基数值较理论的６－７个碱基（表一）更能满足测序胶电泳要求的条件：分子大小在５００ｂｐ左右,每条泳道上条带数在１００条左右。该方法近年来又有如下改进：一、ＰＣＲ退火温度由４２℃改为４０℃,可在保证特异性的同时,增加泳道上的     

一种鉴别基因差异表达的新方法——差异表达mRNA呈现技术

最近发明一种称为差异表达的ｍＲＮＡ呈现技术,鉴别不同细胞群体间的基因表达质和量之差异。以其ｍＲＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增所得到的ｍＲＮＡ３′末端片段可以快速进行序列分析,又可作为探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ或Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,用以确定和分离这些差异表达的基因种类。     

植物发育基因克隆技术的新进展

过去２０年,人们已经分离到了相当数量的与发育相关的基因。这主要借助于蛋白质产物的分离纯化,然后根据其氨基酸结构推算其相应的核苷酸序列,并据此合成寡核苷酸探针,最终从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中筛选出目的基因。而未知其编码产物的发育基因的分离克隆则是非常困难的工作,以前广泛应用的主要方法有ＤＮＡ标签法（ＤＮＡｔａｇｇｉｎｇ）［１,２,３］,作图克隆法（ｍａｐ－ｂａｓｅｄｃｌｏｎｉｎｇ）［４］,差别筛选法（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）［５］和扣除杂交法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［６,７,８］。这些方法虽然都取得了一定的成功,但由于各自的缺陷性,而限制了它们更加广泛的应用。近年来在ＰＣＲ技术的基础上,人们已经建立了若干种分离克隆植物发育基因的新方法。１９９２年,ＬｉａｎｇＰ和ＰａｒｄｅｅＡ［９］首次提出并运用了ｍＲＮＡ差别显示技术（ｍＲＮＡｄｉｆ－ｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ,ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）来进行基因的分离。实践表明,ｍＲＮＡ差别显示技术在分离、鉴定差别表达的新基因方面与以前的各种技术相比有其独特的优越性,但同时它也存在着重复性较差等缺点。因此,最近研究工作者又在其基础上,发展了诸如代表性差式分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ,ＲＤＡ）［１０,１１］和抑制性扣除（或减去）杂交（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ,ＳＳＨ）［１２］等一些更新的方法。下面就此作一简要概述。     

一种鉴别基因差异表达的新方法

最近发明一种称为差异表达的ｍＲＮＡ呈现技术，鉴别不同细胞群体间的基因表达质和量之差异，以其ｍＲＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增所得的ｍＲＮＡ３‘末端片段可以快速进行序列分析，又可作为探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ或Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，用以确定和分离这些差异表达的基因种类。     

mRNA差异展示PCR的进展

ｍＲＮＡ差异展示ＰＣＲ的进展崔大祥闫小君苏成芝（第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所,西安７１００３２）关键词ｍＲＮＡ差异展示聚合酶链反应ｍＲＮＡ差异展示（ｍＲＮＡｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ,ＤＤ）是目前筛选差异表达基因最有效的方法,自１...     

一种鉴别差异表达基因的新方法：———cDNA示差分析技术

ｃＤＮＡ示差分析技术是继ｍＲＮＡ差异显示技术之后又一种鉴别差异表达基因的方法。该技术利用双链ＤＮＡ模板在ＰＣＲ时呈指数扩增,而单链ＤＮＡ模板为线性扩增原原理,先用常见的限制性内切酶将实验组与对照组消化成平均长度为２５６ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,再用ＰＣＲ技术使用组的ｃＤＮＡ片段富集,随后进行３次差减杂交去除共有基因,最后扩增实验组中的特异表达的基因。本概述了该技术的原理、基本方法及其应用前景。     

研究基因转录的RT-PCR技术

ＤＮＡ模板序列的转录调控是基因表达多级调节过程的关键 ,细胞周期中基因转录水平的改变应激细胞发育、分化及正常生理功能的多种信号转导。疾病或其它因素也应激转录水平变化 ,从而改变各种ｍＲＮＡｓ的稳定性。因此基因的ｍＲ ＮＡ水平分析 ,在基因调控研究领域是必不可少的。ｍＲＮＡ的常规分析方法是Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｓ、ＲＮＡｄｏｔ/ｓｌｏｔｂｌｏｔ、核酸酶保护法(ｎｕｃｌｅａｓｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ)和原位杂交 (ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)。而ＰＣＲ技术的应用开创了ｍＲＮＡ分析新方法[1 -3] :ＲＮ…     

cDNA3′端代表差异显示分析

根据真核ｍＲＮＡ３′端一般含Ｐｏｌｙ（Ａ）的原理,可使用共同引物将不同的ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,然后设计特殊引物进行反转录ＰＣＲ,或者将限制性酶切与反转录ＰＣＲ偶联使用,均可获得对应于ｍＲＮＡ３′端的ｃＤＮＡ３′端代表扩增子。比较不同条件下的ｃＤ－ＮＡ３′端代表扩增子,可以获得两种或多种细胞中ｍＲＮＡ的表达差异谱,并分离、克隆差异表达的基因序列     

鉴别差异表达基因的新方法—抑制消减染交法（SSH）

抑制消减杂交法是最近报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法。该方法是以抑制ＰＣＲ和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现ｍＲＮＡ的均等化和消减步骤。本文对ＳＳＨ法的原理,优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如ｍＲＮＡ差别显示江,代表性序列差异分析比较,认为ＳＳＨ方法具有高效快速,高敏感性和假阳性低等优点。