Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。     

大鼠成骨细胞特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别大鼠成骨细胞的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用完整细胞为靶标的消减细胞SELEX技术筛选大鼠成骨细胞特异ssDNA适配体,通过荧光显微镜、流式细胞术、基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过6轮消减细胞SELEX筛选,荧光显微镜鉴定文库已富集;通过流式细胞术检测及测序分析,得到2条适配体L54和L66与大鼠成骨细胞特异结合,其平衡解离常数分别为494.4±133.3和511.4±160.7 nmol/L。结论:筛选获得特异识别大鼠成骨细胞的ssDNA适配体。     

细胞特异性核酸适配体筛选新策略的研究进展

核酸适配体(aptamer)是在体外采用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列(RNA或DNA),能折叠成特定的三维空间结构同靶物质进行高特异性与高亲和性的结合。近年来,以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)获得的核酸适配体在疾病相关的领域有很大的应用潜力,尤其在细胞分子的识别、生物标志物的发现等方面,但cell-SELEX的过程复杂、难度大及获得的核酸适配体性能不佳等问题仍然制约着细胞特异性核酸适配体的进一步发展,如何高效地筛选获得核酸适配体是其应用的关键。本文总结了目前在cell-SELEX技术基础上发展起来的新方法、新策略及核酸适配体在肿瘤研究中的应用,望为相关科研人员的研究提供参考。     

随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立

指数富集配基的系统进化(SELEX)技术是一种新的组合化学技术.体外构建了一个长度为81 nt、含有35个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,优化了ssDNA文库扩增为双链DNA (dsDNA)文库的PCR反应条件.通过对比不对称PCR和生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库的效果,确定了以生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA.由于脱氧核糖核酸的疏水性导致ssDNA文库与硝酸纤维素滤膜的结合背景过高,因此选择以微孔板为介质,分离与靶蛋白结合的适配子.经过9轮循环筛选,随机ssDNA文库与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(C蛋白)的结合率从0.5%上升到32.5%.     

全细菌SELEX法筛选粪肠球菌特异性适配体

肠球菌（Enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌,检出率仅次于大肠杆菌,从分子水平上发展靶标的高亲和力分子探针对肠球菌的识别和检测具有非常重要的意义。本研究以粪肠球菌为靶标,运用全细菌指数富集的配体系统进化技术（whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment, whole-bacteria SELEX）,从全长为79个核苷酸包含35个随机碱基序列的单链DNA文库中筛选与靶标高亲和力、高特异性结合的适配体,利用荧光分析法监控筛选过程中不同轮次所得次级文库与粪肠球菌的结合力,经12轮筛选和克隆测序,获得了39条适配体序列。进一步对筛选得到的适配体进行序列比对、二级结构分析、流式细胞分析、解离常数（Kd）测定及特异性验证,最终获得一条与粪肠球菌能特异性结合的适配体Apt 21,其Kd值为549.2 ± 147.4 nmol/L。该适配体可作为粪肠球菌检测的识别元件,为建立基于适配体的新型粪肠球菌检测方法奠定了基础。     

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的DNA适配体筛选

目的:筛选获得特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)的单链DNA适配体。方法:合成全长81 nt,中间含39个随机序列的单链寡核苷酸(ss DNA)文库,运用指数富集配基系统进化(SELEX)技术筛选获得GPC1适配体;酶联免疫吸附分析法(ELISA)实验确定候选适配体与GPC1蛋白的亲和力,流式细胞术确定候选适配体与2种GPC1高表达细胞系(胰腺癌Panc-1细胞和工具细胞Luc-ZR-75-1~(GPC1))的结合特异性。结果:经过10轮SELEX筛选获得#9适配体,ELISA分析其亲和力为44±0.69 nmol/L,流式细胞术结果表明其与胰腺癌Panc-1细胞和Luc-ZR-75-1~(GPC1)细胞的阳性结合率分别为44.69%和51.44%。结论:筛选获得与GPC1蛋白有较高亲和力、与表达GPC1细胞系特异结合的ss DNA适配体。     

发光核酸适配体的筛选及应用

发光核酸适配体(light-up nucleic acid aptamers,LNAs)是一类能够特异性结合目标分子并增强目标分子发光性能的功能核酸(functional nucleic acids,FNAs)。LNAs具有组成简单、结构稳定、表达时间短等优点,因此在细胞成像、物质检测等传感领域显示出巨大潜力。随着对细胞内基因原位分析的研究深入,现存胞内成像技术的不足逐渐显露,LNAs成像系统应运而生。本文梳理并概括了不同类型LNAs的筛选方法,并从胞内、体外两个方面对LNAs的前沿应用进行了分析,指出了当前LNAs研究以及传感系统存在的不足,展望了LNAs在无细胞传感中的巨大发展前景,以期能够促进LNAs系统成为胞内外传感研究的一件利器。     

人FcγRI特异性核酸适配体的体外筛选及鉴定

人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术——从体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选人FcγRI的高亲和力和高特异性的核酸适配体(aptamer)。本文以人FcγRI为靶标,将其固定在羧基活化磁珠上,进行SELEX筛选。经过8轮筛选,共获得3个重点研究的单克隆适配体。生物信息学分析结果显示,人FcγRI适配体的模拟二级结构以茎-环和G-四聚体为主,可能是FcγRI与适配体的作用位点,G-T错配常见。流式细胞计量术和荧光显微镜分析显示,筛选出的典型单克隆适配体解离常数(the dissociation constant,Kd)均达到纳摩尔水平,而且适配体只与脓毒血症中性粒细胞结合,具有良好的亲和力和特异性。本研究表明,通过SELEX技术,成功获取了人FcγRI特异性核酸适配体,为以此适配体为分子探针,进一步建立用于脓毒血症早期诊断的新方法奠定了基础。     

细胞SELEX技术用于胰腺癌细胞特异性适配体的筛选及鉴定

细胞SELEX是目前常用的筛选细胞特异性适配体的技术。胰腺癌细胞特异性适配体在胰腺癌的诊断和治疗中有巨大的应用潜力。本研究拟通过该技术获得特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体,并对所筛选的适配体进行功能鉴定。本研究以胰腺癌PANC-1细胞为正筛细胞,正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7为负筛细胞,通过磁珠法细胞SELEX技术进行筛选。经过12轮筛选,对筛选文库进行PCR扩增、质粒转染、单克隆挑选及测序,获得2条适配体Apt-5和Apt-12。流式细胞术检测发现,适配体Apt-5和Apt-12可特异性识别PANC-1细胞,其Kd值分别为8.27±2.10 nmol/L和8.88±2.51 nmol/L,Kd值均处于纳摩尔级别。通过RNA结构预测,2条适配体的二级结构均为茎-环结构。细胞免疫荧光验证了适配体的结合部位为细胞膜表面。本研究表明,通过磁珠法细胞SELEX技术,成功获得可特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体。该适配体有望成为胰腺癌诊断和治疗中的特异性分子靶向剂。     

核酸适配体筛选技术研究进展

核酸适配体是一段特殊的寡核苷酸配基,对靶标有亲和力和特异性。核酸适配体发展十分迅速,但筛选方法的研究相对来说还不能满足适配体应用的需求。笔者从筛选过程出发,针对近年来较为新颖热门的非天然核苷酸替代传统核苷酸、镜像核酸库代替核酸库等核酸库优化方法,毛细管电泳筛选、微流控芯片技术、微阵列芯片、粒子展示等筛选策略改进技术,高通量测序等次级文库序列分析,碱基突变与修饰、序列截短等适配体结构优化等具体内容进行总结,探讨各种方法的研究进展及应用前景。     

适配体的筛选及在生命分析化学中的应用

指数级富集的配体系统进化技术（SELEX）是近年来发展的获得能够与靶分子高特异性和高亲力结合的寡核苷酸序列（适配体）的筛选技术。目前多种靶分子的适配体如蛋白或小分子,都已经通过SELEX技术筛选获得,使适配体在蛋白质组研究、临床医学、药物研发及基因调控等领域已经成为重要的研究工具。本文就近几年适配体的筛选技术及在生命分析化学中的应用发展方面进行了综述。     

计算机辅助筛选核酸适配体技术

计算机信息技术已经渗透到我们生活的方方面面,不仅可以辅助药物的筛选,也能够模拟药物的作用.目前已有研究使用计算机辅助技术筛选适配体,对筛选效率的提升和筛选高亲和力的适配体有着重要的指导作用.文中将主要对计算机通过序列评估、结构分析、分子对接3个方面辅助适配体筛选的方法进行综述.     

核酸适配体及其亲和力的表征方法

介绍核酸适配体及体外指数富集配体系统进化技术的原理,着重介绍核酸适配体不同靶标的亲和力表征方法,并对这些方法的优、缺点进行比较,建议未来可以联合多种互补的检测技术进行亲和力的相互印证。     

人FcγRI特异性核酸适配体的体外筛选及鉴定北大核心CSCD

人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术——从体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选人FcγRI的高亲和力和高特异性的核酸适配体(aptamer)。本文以人FcγRI为靶标,将其固定在羧基活化磁珠上,进行SELEX筛选。经过8轮筛选,共获得3个重点研究的单克隆适配体。生物信息学分析结果显示,人FcγRI适配体的模拟二级结构以茎-环和G-四聚体为主,可能是FcγRI与适配体的作用位点,G-T错配常见。流式细胞计量术和荧光显微镜分析显示,筛选出的典型单克隆适配体解离常数(the dissociation constant,Kd)均达到纳摩尔水平,而且适配体只与脓毒血症中性粒细胞结合,具有良好的亲和力和特异性。本研究表明,通过SELEX技术,成功获取了人FcγRI特异性核酸适配体,为以此适配体为分子探针,进一步建立用于脓毒血症早期诊断的新方法奠定了基础。     

噬菌体434单链阻遏蛋白高亲和力DNA配体的筛选和设计

单链阻遏蛋白R R_TRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物,含有两个DBD(DNA结合结构域),一个是野生型噬菌体434的DBD-R,另一个是突变型DBD-R_TRES,二者用重组接头以头接尾的方式连接起来.R_TRES的α-3-螺旋中-1,1,2,5位DNA结合氨基酸分别为T,R,E,S. 利用核心序列是CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG的随机DNA库, 体外循环筛选R_TRES的DNA结合位点,将筛选到的群体克隆、测序.单链阻遏蛋白RR_TRES的亲和力测定表明,最适操纵区序列含有TTAC或TTCC(上述画线部分)时,K_d值在10^-12~10^-11mol/L的范围.天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的K_d值在10^-9 mol/L数量级,与之相比,所筛选操纵区的亲和力明显提高.同时发现,亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响,特别是5′位碱基的影响.根据R_TRES的识别特性,设计了共有序列为GTAAGAAARNTTACN或GGAAGAAARNTTCCN (R为A或G)的单链阻遏蛋白R_TRES R_TRE的操纵区序列.结果表明,它们之间有特异性结合,且亲和力也很高.此方法可望用于其他DNA结合蛋白新的结合特异性的筛选.     

特异性肝癌细胞结合单链抗体的筛选及克隆表达

用人肝癌细胞系SMMC7721免疫小鼠,提取脾细胞总RNA,构建单链抗体库,从中筛选到1个与人肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体－单链抗体。此单链抗体与HepG2细胞结合滴度比正常肝细胞低100倍以上。构建表达质粒pTrx-scFv5-56,单链抗体scFv5-56在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地进行了可溶性表达。     

核酸适配体筛选的改良与优化策略

核酸适配体以其类似抗体的功能及诸多优于抗体的特点引起人们的广泛关注,如何利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX技术)来高效地筛选核酸适配体是其应用的关键。结合近些年核酸适配体的研究进展,为提高筛选效率及核酸适配体性能,针对适配体筛选三大不同环节所做的尝试及改良进行相关的阐述,包括初始随机寡核苷酸文库的设计与修饰、筛选过程所用方法及次级文库的制备、筛选过程后(Post-SELEX)核酸适配体性能的优化等;特别比较了筛选方法包括毛细管电泳SELEX、细胞SELEX、磁珠SELEX、加尾SELEX、微流控SELEX、微阵列SELEX和高通量SELEX,以及次级文库的制备方法诸如不对称PCR法、λ核酸外切酶法、磁珠法、不等长PCR法、综合性方法等;对核酸适配体发展面临的问题及发展前景进行探讨,以期为相关科研人员的研究提供参考。     

氧化石墨烯在适配体筛选及医学应用方面的研究进展

SELEX是一种较为成熟的适配体筛选技术,在筛选过程中也涌现出了一系列的筛选方法,如磁珠法、硝酸纤维素法、毛细管电泳法、细胞法等。本文介绍了一种更加快速准确的筛选方法——氧化石墨烯法(graphene oxide,GO-SELEX)。氧化石墨烯具有独特的物理化学性质,筛选效率更高,在对小分子的适配体筛选方面具有其独特的优势。另外,基于氧化石墨烯的适配体目前也逐渐应用于药物靶向运输、肿瘤细胞检测、病原体或生化指标检测等领域,在医学方面具有广阔的应用前景。     

DNA适配体与金属离子的结合机理的探究

核酸适配体是一类经过体外筛选获得的功能性寡核苷酸序列片段,能与特定的靶标进行高特异性与强亲和力的结合,以金属离子作为靶标的核酸适配体是适配体技术发展的一个重要研究方向。本文综述了近些年来国内外核酸适配体与金属离子的结合机理,并对该领域目前存在的问题进行分析和展望。     

应用双向热循环消减SELEX技术筛选肺癌血清核酸适配体

肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到 40条非癌核酸适配体序列和 41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的 4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为 90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。