抗人AFP单链抗体与藻胆蛋白融合蛋白的构建、表达与活性分析

目的:构建多基因表达载体,在大肠杆菌中同时表达AFP单链抗体(scFv)和蓝藻别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白(apcA)组成的融合蛋白(scFv-apcA)、藻胆蛋白裂合酶(cpcS)及藻红蛋白生物合成酶(Ho1和pebS),获得共价结合藻红胆素的融合蛋白(scFv-apcA-PEB)。方法:利用融合PCR将scFv和apcA基因连接起来,形成scFv-apcA融合基因,并将该融合基因与cpcS克隆到表达载体pCDFDuet-1中;将Ho1和pebS基因克隆到表达载体pRSFDuet-1中。将两种载体共转化到大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白表达,经亲和层析获得重组蛋白,通过光谱学分析和抗体竞争性抑制法,测定重组蛋白的生物学活性。结果:成功表达融合蛋白scFv-apcA-PEB,分子质量约为45kDa,与理论值相符,其最大吸收峰为549.5nm,最大荧光发射峰为560nm,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到48%。结论:利用大肠杆菌表达系统,获得了同时具有荧光特性和免疫学活性的重组蛋白。     

集胞藻6803藻胆体别藻蓝蛋白多克隆抗体的制备

藻胆体是蓝藻细胞主要的捕光天线色素超分子复合体,主要由核心体和外围的杆两部分组成,核心体主要由别藻蓝蛋白组装而成,参与光能向光合作用反应中心的传递.该研究通过PCR扩增出集胞藻6803别藻蓝蛋白α亚基(ApcA)编码基因apcA,构建表达质粒pET-32a(+)-apcA,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株中;通过IPTG诱导表达重组蛋白,并利用组氨酸标签将可溶性目的蛋白进行亲和纯化后,免疫日本大耳白兔,从而获得多克隆抗体.间接ELISA法揭示ApcA抗体效价可高达1∶1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性.表明该研究成功制备了集胞藻6803藻胆体别藻蓝蛋白多克隆抗体,为进一步研究藻胆体的核心体在光能传递过程中所承担的重要生理角色奠定了生化基础.     

犊牛前胸腺素α基因在大肠埃希菌中的表达及活性分析

以RT-PCR法扩增犊牛前胸腺素α基因(prothymosin-α,ProT-α),与原核表达载体pGEX-4T-1连接生成重组质粒pGEX/ProT-α,再将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)。重组菌经IPTG诱导后表达的GST-ProT-α融合蛋白主要存在于细菌裂解液中。SDS-PAGE电泳表明,GST—ProT-α融合蛋白表达量较高,分子量为38 ku;Western-blot和动物细胞试验表明,该产物能与胸腺素α1抗体发生特异性免疫反应,并可显著提高小鼠脾细胞增殖率和NK细胞杀伤活性。     

人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定

目的克隆并表达人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株的融合蛋白(F)基因片段。方法利用PCR技术扩增HRSV兰州株的融合蛋白基因片段,克隆于原核表达载体pET-42b(+),转化大肠杆菌(Rosetta),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。结果 PCR扩增得到951 bp的DNA片段,重组质粒pET42b-F经酶切鉴定和测序分析,表明质粒构建正确。表达的重组蛋白的相对分子质量为68 710,表达的重组蛋白占总菌体蛋白的7%,纯化后蛋白纯度达80%。经Western-blot分析,重组蛋白与抗RSV的单抗呈专一性强阳性反应。结论成功构建了HRSV兰州株F基因片段原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta中获得了表达,表达的重组蛋白具有反应原性和特异性,为HRSV感染引起的疾病血清学诊断以及试剂盒的研发提供了材料。     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体的构建及表达

目的构建阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体并诱导其体外表达。方法pMD-18T-ap33重组质粒和pUC18空质粒经BamH Ⅰ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,将ap33基因亚克隆入pUC18载体并进行筛选和鉴定。重组质粒经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳及Western-blot杂交鉴定重组蛋白。结果经双酶切及PCR鉴定,构建的重组质粒为阳性重组子,诱导出的重组蛋白大小约为Mr36000,与理论值基本相符。结论成功构建重组质粒并获得体外表达。     

海洋红藻和蓝藻中的别藻蓝蛋白结构特征的比较

红毛菜、坛紫菜和条斑紫菜三种海洋红藻中的别藻蓝蛋白的特征吸收光谱(λ_(max)650 nm),荧光发射光谱(F_(max)662nm)、等电点(pI 4.42)、聚集态(分子量:134 kD)及其亚基分子量(α17kD,β18.5kD)均相同;结合它们各自吸收光谱的二阶导数光谱、圆二色谱和氨基酸残基组成等,与蓝藻--螺旋藻中的别藻蓝蛋白进行了比较。研究结果表明:四种来源不同的别藻蓝蛋白结构具有同一性,都是由α和β两个亚基组成的(αβ)_3结构。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化

目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL（BLCAP）SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32（a）中,从而构建原核表达重组质粒pET-32（a）-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化回收,并采用SDS—PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32（a）-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达(英)

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

内江猪IL-18基因的克隆及原核表达

以ConA刺激的内江猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)为模板,采用RT-PCR技术扩增出猪IL-18全长基因,克隆其成熟蛋白的编码基因(471bp)至pMD18-T克隆载体,经双酶切和测序获得阳性克隆。通过EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切及连接反应,构建了pET-32a( )-IL-18原核表达质粒。经双酶切和DNA测序证实重组质粒构建正确,将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot证实表达出35kD左右的融合蛋白。经实验确定重组内江猪IL-18蛋白诱导表达的最佳条件为IPTG 0.2mmol/L,30℃诱导培养5h。在最佳表达条件下,pIL-18的相对含量为59.6%。内江猪IL-18的原核表达为重组IL-18的纯化及其生物学功能的进一步研究提供了基础。     

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达载体的构建及表达纯化

为了在原核细胞中表达青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtaunese S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adeno-sylhomocysteine hydrolase,SAHH),采取构建文昌鱼SAHH基因的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-SAHH的方法,转化入大肠杆菌JMl09感受态细胞中,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化.结果经SDS-PAGE分析,重组质粒在JM109中表达并纯化得到的融合蛋白大约为70 kDa,成功构建了文昌鱼SAHH基因原核表达载体,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白.     

薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建

利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS)基因特异引物,扩增得到GPPS基因开放式阅读框(1 131 bp),并将其插入到原核表达载体pET-28a中,经酶切测序验证的重组质粒pET-28a-GPPS转入Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示,终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导后6 h,SDS-PAGE显示薄荷GPPS基因在Rosetta(DE3)中获得高效表达。目前利用RNA干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟,以GPPS大亚基基因为靶目标,成功构建了薄荷GPPS大亚基基因的pBI121-RNAi-GPPS干扰载体。     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与原核表达

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害全球养猪业的重要病毒性传染病。通过PCR方法从高致病性PRRSV WUH1株中扩增得到结构蛋白ORF7的基因片段,并将目的基因插入原核表达载体pET-30a中,得到重组表达质粒pET-30a-ORF7。重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,融合蛋白得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量约20kD。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

CTB-FimA融合蛋白原核表达纯化及其免疫效果

[目的]构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌毛蛋白(FimA)与霍乱毒素B亚基(CTB)重组质粒pET-32a/CTB-FimA,表达纯化CTB-FimA融合蛋白并对其黏膜免疫效果进行研究。[方法]根据GenBank查找FimA基因和CTB基因,利用(Gly₄Ser)₃连接肽序列构建pET-32a/CTB-FimA原核表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),确定IPTG诱导浓度及温度,SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性;采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化目的蛋白CTB-FimA;用纯化的目的蛋白作为免疫原鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠观察其黏膜免疫效果。[结果]经双酶切和测序鉴定pET-32a/CTB-FimA重组表达质粒构建成功;IPTG最适诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为23℃,重组蛋白CTB-FimA主要以可溶形式表达;Expasy软件ProtParam工具预测重组蛋白分子量约为72.08 kDa,亲水性总平均值为-0.313;每升发酵液表达CTB-FimA蛋白约100 mg;免疫...     

羊流产嗜衣原体ompA基因的克隆与表达

目的:克隆羊流产嗜衣原体ompA基因,获得原核表达ompA蛋白。方法:以前期构建的质粒pMD-18T-ompA为模板,扩增出无信号肽无终止子ompA基因1 101bp条带,亚克隆至原核表达载体pet-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),重组质粒稳定性测试合格后经1mmol/L IPTG诱导表达4h,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白的表达结果。结果:本试验成功获得60kDa重组ompA蛋白,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在,免疫印迹显示可与山羊流产嗜衣原体阳性血清反应,具有免疫原性。结论:成功建立ompA基因的原核表达方法,为后续ompA蛋白的功能研究奠定基础。     

盐藻小G蛋白DsRab的原核表达及纯化

前期对盐藻小G蛋白基因DsRab研究表明,在盐胁迫诱导下该基因转录水平明显提高。为进一步研究该蛋白在盐藻耐盐机制中的作用,PCR扩增DsRab的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体pGS-21a,得到重组表达载体pGS-21a-DsRab。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并优化诱导表达条件,利用GST-SefinoseTM Kit进行纯化,用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,成功构建了重组表达载体pGS-21a-DsRab,SDS-PAGE结果显示得到的蛋白与预期分子量相符,并且纯度较高;Western blot检测结果初步证明该融合蛋白为GST-DsRab。