坛紫菜中别藻蓝蛋白的纯化及洗脱组分光谱研究

以福建省平潭县坛紫菜(Porphyra haitanensis)为材料,采用硫酸铵分级分离和柱层析法纯化别藻蓝蛋白(APC),并对纯化的条件进行了详细的探讨。研究结果表明:采用30%~35%饱和硫酸铵沉淀、Tris-HC l(pH=8.0)作为洗脱缓冲液、DEAE-Sephadex-A-50作为层析介质,所获得的APC的纯度和回收率分别为3.50和70.2%;SDS-PAGE表明APC有α和β两个亚基,分子量分别为18.9 kD和17.7 kD。因此该方法对于从坛紫菜中快速纯化APC是适合的。采用光谱分析研究柱洗脱组分,结果表明:坛紫菜中含有分子结构为(αβ)6γ的“双峰型”R-PE,含有结构为(αβ)3的R-PC,含有结构为(αβ)3的APC-Ⅱ。     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

别藻蓝蛋白的聚集态研究

为了研究鱼腥藻PCC7120（Anabaena sp．PCC7120）中别藻蓝蛋白（APC）α和β亚基（α-APC和β-APC）中藻蓝胆素（PCB）与脱辅基蛋白的生物合成,并在蓝藻体外对这两种色素蛋白PCB—ApcA和PCB-ApcB合成时聚集过程进行分析,通过多种组合的质粒在大肠杆菌体内共同表达进行重组。色素蛋白的吸收和荧光光谱以及Zn电泳表明,在大肠杆菌体内同时得到色素蛋白PCB—ApcA和PCB—ApcB,并且体内重组色素蛋白的细胞荧光光谱显示,色素蛋白以三聚体的形式存在,而破碎细胞后所得上清液所显示的光谱特征为单聚体的特征。     

坛紫菜藻红蛋白的规模化制备

为了优化坛紫菜粗提工艺以减轻纯化的压力,研究了我国主要经济红藻之一坛紫菜藻红蛋白大规模制备方法。实验采用“溶胀+组织捣碎”法破碎坛紫菜叶状体细胞,对比了多次硫酸铵梯度盐析对破碎液中藻红蛋白的影响,并进一步用羟基磷灰石层析制备藻红蛋白,最后对所得蛋白做了光谱和电泳鉴定。结果表明,经过4次盐析,藻红蛋白吸收光谱纯度达到0.9 (A564/A280),每次的最佳盐析浓度分别为15％、50％、10％和40％;7 kg阴干紫菜经过4次盐析和1次羟基磷灰石层析后可获得507.82 mg藻红蛋白 (A564/A280＞     

嗜热蓝藻优雅粘囊藻藻胆体的特性和别藻蓝蛋白的亚基组成

研究了优雅粘囊藻藻胆体的特性。从聚丙烯酰胺凝胶电泳、吸收光谱和二阶导数图谱可证明,它的ＰＢＳ含有一种红色藻胆蛋,两种Ｃ－藻蓝蛋白和三种别藻蓝蛋白。但是,用ＰＡＧＥ和羟基磷灰石柱层析分离和纯化所得藻胆蛋白,一般仅得到一种Ｃ－ＰＣ和一种亚基组成特殊的别藻蓝蛋白ＡＰＣ。这种ＡＰＣ吸收光谱和荧光发射相同于已报告的ＡＰＣ６６０ｎｍ。但是它的亚基组成是（αα＇ββ＇）２而不是（α＇α２β２β＇）Ｌｃ＾１０或α     

别藻蓝蛋白藻蓝胆素发色团分子构象研究

主要研究了蓝绿藻污棕席藻(Phormidium luridum)别藻蓝蛋白在不同 pH值条件下的吸收光谱和共振拉曼光谱.发现低聚化的结果导致了三聚体别藻蓝蛋白 650nm 特征吸收峰的消失和一些共振拉曼带强度和位置的移动.结果表明在低 pH 值作用下的低聚化的别藻蓝蛋白中藻蓝胆素发色团分子的构象和自由胆素分子类似,比三聚体的别藻蓝蛋白的发色团分子更趋于卷曲,折叠的构象态.而三聚体的别藻蓝蛋白,主要的拉曼带 1645cm^-1是其发色团分子构象处于更线性延展的标志,其光谱行为和吸收光谱 A_vis/A_uv所表征的发色团分子构象的结果相一致.     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白α和β亚基基因序列测定及分析

为了获得江苏吕泗的条斑紫菜藻红蛋白α(Pea)和β(Peb)亚基、藻 蓝蛋白α(Pca)和β(Pcb)亚基基因的DNA序列,本文对其基因进行了克隆、 序列测定及分析.根据已发表的基因序列(DQ666487.1)设计引物,对提取自 条斑紫菜叶状体的DNA进行PCR和电泳鉴定,产物经测序证实获得藻红蛋白 序列1 357 bp (HM008263.1)和藻蓝蛋白序列1 335 bp (HM008262.1).上述 两段序列与已报道的条斑紫菜相关序列(DQ666487.1)同源性均为99％,与 其它几种紫菜相关序列同源性为88％～98％.两段序列均采用多顺反子转录 策略,排布顺序为5′Untranslated Regions(UTR)- Peb -间隔区- Pea -3 ′UTR 和 5′UTR- Pcb -间隔区- Pca -3′UTR.文中对基因翻译所得氨基 酸序列做了理化参数、功能位点及空间构型的预测.基于对序列开放阅读框 、启动子、Shine-Dalgarno (SD)序列的分析,本文对条斑紫菜分类地位进 行了讨论.     

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白亚基和F_(678)色素蛋白

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白包含有两个亚基。β亚基具有578nm吸收峰和600nm荧光发射峰,分子量19.80±0.40KD,可表明β亚基仅有一个载色团。α亚基具有578nm和630nm吸收峰及645nm的荧光发射峰,分子量17.35±0.38,α亚基可能有两个载色团。别藻蓝蛋白有635nm和650nm吸收蜂及664nm的荧光发射峰。具藻胆体的类囊体膜从高盐浓度缓冲液移至低盐浓度缓冲液时表现678nm荧光发射峰,可能柱孢鱼腥藻存在的F_(678)色素蛋白相当于GLazer(1975)的别藻蓝蛋白B。     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白逐级放大的纯化工艺

采用“破碎-盐析-层析”的方法纯化条斑紫菜藻胆蛋白,并在提取规模上逐步放大。首先在综合比较凝胶层析去盐效率后,从Sephadex G-25、G-100、S-300和CL-6B中选择G-25作为实验流程中的去盐填料,其次将提取流程的初试原料条斑紫菜量逐步放大,选取了1g、20g和400g三个量,结果表明随着初试紫菜量逐步放大,最终所得藻胆蛋白中吸收光谱纯度>3.2的蛋白产率依次提高,其中400g冻干紫菜的藻红蛋白产率为0.323％,藻蓝蛋白产率为0.148％。由此认为该实验工艺流程具有规模放大的潜力,这为高纯度藻胆蛋白的规模生产提供了一条可行的方案。     

螺旋藻别藻蓝蛋白的纯化、理化特性与结晶

硫酸铵分级沉淀结合多种层析技术,从螺旋藻（SP—Dz）中纯化到电泳纯别藻蓝蛋白（Allophycocyanin,APC）,纯度（A650／A280）达4．83。APC在30min内的荧光扫描曲线为直线;30min连续光照其相对荧光强度仍为原来的98％以上,其抗荧光淬灭能力强于同样条件下的藻蓝蛋白（PC）及荧光素TRITC。用悬滴气相扩散法培养获得了APC晶体。     

集胞藻6803藻胆体别藻蓝蛋白多克隆抗体的制备

藻胆体是蓝藻细胞主要的捕光天线色素超分子复合体,主要由核心体和外围的杆两部分组成,核心体主要由别藻蓝蛋白组装而成,参与光能向光合作用反应中心的传递.该研究通过PCR扩增出集胞藻6803别藻蓝蛋白α亚基(ApcA)编码基因apcA,构建表达质粒pET-32a(+)-apcA,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株中;通过IPTG诱导表达重组蛋白,并利用组氨酸标签将可溶性目的蛋白进行亲和纯化后,免疫日本大耳白兔,从而获得多克隆抗体.间接ELISA法揭示ApcA抗体效价可高达1∶1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性.表明该研究成功制备了集胞藻6803藻胆体别藻蓝蛋白多克隆抗体,为进一步研究藻胆体的核心体在光能传递过程中所承担的重要生理角色奠定了生化基础.     

蓝细菌别藻蓝蛋白ApcE与ApcF不形成复合物

进行了Anabaena sp.PCC7120的别藻蓝蛋白ApcE与ApcF的体内重组的光谱和apcE和apcF基因的细菌双杂交的研究。在提纯前PCB-ApcE/PCB-ApcF的吸收及荧光光谱峰与PCB-ApcF的峰位置一致,而提纯后PCB-ApcE/PCB-ApcF的吸收及荧光光谱峰与PCB-ApcE的峰位置一致,表明ApcE与ApcF不能形成复合物。pBT-apcF与pTRG-apcE的转化细胞能在无3氨基-1,2,4三氮唑（3-AT）的非选择性培养基上生长,而不能在有3AT的选择性培养基上生长,说明在转化过程中未产生能抗3-AT的HIS3报告基因,进一步证实ApcE与ApcF间没有相互作用。     

嗜热蓝藻优雅粘囊藻藻胆体的特性和别藻蓝蛋白的亚基组成

研究了优雅粘囊藻藻胆体（ＰＢＳ）的特性。从聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）、吸收光谱和二阶导数图谱可证明,它的ＰＢＳ含有一种红色藻胆蛋白,两种Ｃ－藻蓝蛋白和三种别藻蓝蛋白。但是,用ＰＡＧＥ和羟基磷灰石柱层析分离和纯化所得藻胆蛋白,一般仅得到一种Ｃ－ＰＣ和一种亚基组成特殊的别藻蓝蛋白ＡＰＣ。这种ＡＰＣ吸收光谱和荧光发射相同于已报告的ＡＦＣ６６０ｎｍ。但是它的亚基组成是（αα′ββ′）２而不是（α′α２β２β′）Ｌｃ１０或（αβ）３。     

念珠藻葛仙米藻蓝蛋白α与β亚基基因克隆、表达及其单体结构模拟

天然抗氧化剂对于清除人体内自由基、保障健康具有重要作用。藻蓝蛋白(phycocyanin, PC)是蓝藻等藻类细胞内的一类特殊色素蛋白,具捕获光能的功能。体外研究发现,藻蓝蛋白具有较显著的抗氧化、抑癌细胞增殖等生物活性。试验利用食源性的拟球状念珠藻葛仙米(Nostoc sphaeroides)的基因组DNA为材料,借助PCR扩增克隆葛仙米藻蓝蛋白两个重要亚基α与β基因,Ns-PC-α和Ns-PC-β。结果表明,葛仙米基因组中,Ns-PC-α和Ns-PC-β基因编码框长度分别为492 bp和522 bp;Ns-PC-α和Ns-PC-β基因以双顺反子形式存在,Ns-PC-α位于Ns-PC-β下游。Ns-PC-α和Ns-PC-β分别编码由163与173个氨基酸组成的蛋白。Ns-PC-α和Ns-PC-β亚基蛋白多肽链中共含有3个半胱氨酸残基(Ns-PC-α的第85位与Ns-PC-β中的第83位氨基酸残基和第154位氨基酸残基),很可能是藻蓝胆素的结合位点。原核表达显示Ns-PC-α和Ns-PC-β分子量为近18 kD,Ns-PC-α比Ns-PC-β略小,与预测结果一致。模拟其高级结构,发现Ns-PC-α和Ns-PC-β单亚基均含有7个α-螺旋,除N端α-螺旋外,其它几个α-螺旋进一步折叠形成疏水核心区;并且,Ns-PC-α和Ns-PC-β结构上能够较好吻合,形成一稳定而封闭的单体,弧度近2π/3。Ns-PC-α和Ns-PC-β组成的这种单体结构是其进一步建构圆盘状三聚体Ns-PC-(α/β) 3的重要基础。本研究结果为食源性念珠藻葛仙米藻蓝蛋白抗氧化功能的进一步应用提供了重要依据。     

富硒螺旋藻中硒别藻蓝蛋白的纯化及其特性

从富硒螺旋藻(Se richSpirulina platensis,Se-SP)中分离纯化高纯度的含硒别藻蓝蛋白(Se-containingallophycocyanin,Se-APC)并观察其生化特性。羟基磷灰石和DEAE-52柱层析方法结合制备电泳技术纯化Se-APC;光谱扫描、Native-PAGE、SDS-PAGE和IEF方法鉴定Se-APC生化特性;2,3-DAN荧光光度法检测蛋白质中Se含量。结果发现3种高纯度Se-APC的光谱特征分别与APCI、APCII、APCIII吻合;电泳鉴定它们可能都是(αβ)3,α、β亚基分别为18.3和15.7 kDa,其pI值分别为:4.76、4.85和5.02;3种Se-APC中Se含量分别为316、273和408μg/g,Se-APC经0.5mol/L NaSCN解聚和β-巯基乙醇变性处理后,蛋白质中Se含量依次减低并趋于稳定。结果提示Se-SP中APC可结合Se,APC中Se含量与其分子聚态有关,亚基中含Se量稳定,可能是以共价键方式结合,Se-APC生物活性及硒在蛋白质中的结合位点值得深入研究。     

鱼腥藻PCC7120藻蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pETDuet-cpcA、pCOLADuet-cpcE-cpcF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpcE和cpcF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻蓝蛋白α亚基基因cpcA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)。通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的CpcA-PCB。成功实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白α亚基84位半胱氨酸残基与PCB的连接。而在裂合酶基因cpcE和cpcF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.2%的CpcA-PCB产生。以上研究为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础。     

从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究

采用新鲜藻丝为原料和分段梯度盐析分离纯化钝顶螺旋藻Sp(NS)-90020的藻蓝蛋白（PC）,经羟基磷灰石一次层析,能使提取的PC的纯度大于普遍认可的标准,由于该工艺流程较为简单,适合藻蓝蛋白的大量生产,藻胆蛋白经Sephadex凝胶过滤后的可达电泳纯度标准,经SDS-PAE测得PC,APC的分子量分别约为38.33kD。