鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和 3'-调控区对目的基因表达水平的影响,为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据.用牛生长激素基因(BGH)poly A 序列替换鸡输卵管表达载体中 ov 3'-调控区,用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列,获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA 的鸡输卵管表达载体,分别命名为 pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K 和 pOV6K.经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体,通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平.结果表明:受控于 3.0kb ov 5'-和3'-调控区的 pOV2K 表达的重组酶活性明显高于用 BGH poly A 替换 3'-调控区的pOV3K;无内含子的pOV6K表达水平显著低于舍不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K 和 pOV5K,重组酶表达水平随第一内舍子的缩短呈逐渐下降趋势.该试验结果表明 ov 第一内含子和 3'-调控区对目的基因在鸡榆卵管细胞中的表达具有正调节作用,应当包括在鸡输卵管表达载体中.     

鹅卵清蛋白基因5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出1．2kb的鹅清蛋白基因5’端调控区,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点(标记为pOV),经酶切和测序鉴定：扩增产物只有3个碱基发生了突变,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明鹅清蛋白基因5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列。为构建其启动外源基因的质粒表达载体奠定了研究基础。     

人促红细胞生成素鸡输卵管特异表达载体的构建

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出1.1kb的鸡卵清蛋白5'端调控区,将其亚克隆人pMD18-T载体的多克隆位点）命名为pOV),经酶切和测序鉴定可作为调控序列来启动外源基因的表达。然后从pOV上切下卵清蛋白5'端调控区,再将其亚克隆入pBCE经SaⅡ和HindⅢ双酶切的切口处,酶切鉴定为正向插入,成功构建了鸡卵清蛋白5'端调控区调控人促红细胞生成素的质粒表达载体pOV-hEPO,为制备生产人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应奠定了基础。     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用5’RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置,通过序列分析得出转录起始点为G,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置。应用PCR技术分别扩增两段卵清蛋白基因上游调控序列的两个片段,长度分别为1．5kb和2．9kb。经PCR测序和克隆测序后,针对突变的碱基进行修复,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP-N2载体上,为使pGFP-N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究,将其切去,构建了P1.5koval-GFP和R2.9koval-GFP两种表达载体,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。     

鸡卵清蛋白基因启动子调控GFP基因在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞的表达

特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列 1340bp～ +16 5 5bp片段和第一内含子 +49bp～ +16 5 5bp片段 ,去除pG FP N2载体自身的CMV启动子 ,分别构建了P_2.9koval GFP和P_1.5koval GFP两种表达载体 ,经测序和酶切鉴定表达载体构建正确。采用脂质体转染法分别将这两种载体、pGFP N2 (阳性对照 )质粒及阴性对照转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞。用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达。结果表明 :两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达荧光蛋白。结果既显示卵清蛋白第一内含子对基因的表达起到一定的调控作用 ,也显示卵清蛋白启动子对输卵管上皮细胞和卵巢细胞不存在特异性 ,并且不存在种属差异性。     

寿光鸡ADSL基因5′调控区的克隆、序列分析以及单核苷酸多态性的研究

腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)是双功能酶,催化嘌呤核苷酸的起始合成与嘌呤核苷酸的循环。通过对寿光鸡ADSL 5′调控区1035bp的序列进行克隆和测序分析,发现其具有典型的管家基因特征：没有真核基因明显的TATA盒和CAAT盒出现,并且位于起始密码子(ATG)前234个碱基具有非常高的GC含量达72．65％。在邻近起始密码子“ATG”处,5′调控区含有两个核呼吸因子-2(NRF-2),在相同位置上人类ADSL基因也具有与此类似的两个核呼吸因子-2结合位点,被认为在嘌呤核苷酸合成途径起到重要作用。值得一提的是位于寿光鸡5′侧翼调控区-27号碱基发生C→T突变,存在于所有研究的寿光鸡个体中,频率为1。该突变使得本来不是NRF-2(核呼吸因子2)结合位点的CTCC突变为NRF-2结合位点CTTC。而人类却恰恰与此相反第一个NRF-2结合位点发生了突变(CTTC→CTCC),并导致出现ADSL缺陷症状。     

植物热激蛋白的功能及其基因表达的调控

本文介绍了植物热激蛋白的产生、分布和分类。着重论述了热激反应的特点、植物热激蛋白的功能、热激基因表达与调控的研究进展     

植物热激蛋白的功能及其基因表达的调控

本文介绍了植物热激蛋白的产：生、分布和分类。着重论述了热激反应的特点、植物热激蛋白的功能、热激基因表达与调控的研究进展。     

鸡卵清提取液中小于3kDa的成分有促细胞增殖的作用

在前期研究中发现,鸡卵清提取液有促细胞存活与增殖的作用。在该研究中,作者进一步分离鸡卵清提取液的各成分,找到促细胞增殖的主要成分。用超滤管将鸡卵清提取液分为大于3 kDa和小于3 kDa的成分,用于细胞增殖活性测定,发现鸡卵清提取液中小于3 kDa的成分有促293T细胞增殖的作用。可将鸡卵清提取液分离小于3 kDa的成分作为促293T细胞增殖的有效成分。     

转基因鸡生物反应器载体的构建及其表达特性分析

以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因,构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体,以巨细胞病毒 (Cytomegalovirus,CMV)启动子表达载体为对照,转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞,通过荧光和酶活性检测,旨在筛选出用于实现转基因鸡生物反应器的高效特异性表达载体。结果发现,鸡卵清蛋白启动子表达载体转染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,没有表现出明显的细胞特异性,且荧光素酶检测结果表明其在各细胞组中表达活性都低于CMV启动子表达载体100倍以上;慢病毒载体感染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,在鸡输卵管上皮细胞组感染单个细胞的病毒颗粒 (Multiplicity of infection,MOI) 为20时绿色荧光蛋白表达量就可以达到CMV启动子表达载体的水平。上述结果表明,基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达,而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。     

鸡生长激素基因5′端部分调控区的克隆分析

利用PCR技术扩增、克隆、测序了7个跨越不同生长速度的鸡品种(系)的生长激素(GH)基因的5′端部分调控区。这7个品种(系)分别为:高生长速度的宝罗肉鸡父本;较高生长速度和一定的产蛋性能的宝罗肉鸡母本;肉蛋兼用型的芦花鸡;中等生长速度和中等体重的蛋鸡品种洛岛红和农大褐;生长速度较慢体重较轻的蛋鸡品种北京白鸡和生长速度很慢但又不是矮小型的地方品种丝毛乌骨鸡。所扩增的片段长度为760bp,包括了转录起始位点5′端侧翼区的473bp、两个可能的TATA框、组织特异性转录因子结合位点、第一个外显子和部分第一内含子。所有克隆的鸡GH基因5′端调控区与Tanaka发表的序列相比,均在-34碱基的位置上缺失一个胞嘧啶C,在 160与 161碱基之间多1个胸腺嘧啶丁,在 175碱基的位置上出现了以腺嘌呤A替换了鸟嘌呤G的情况。7个品种(系)之间的比较显示,鸡GH基因启动区具有极高的保守性,在具有不同生长速度的鸡品种间不存在任何差异。说明鸡的不同生长速度和成年体重,不是由于生长激素5′调控区变异造成的。鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或3′端侧翼序列的影响。     

调控蛋白CRP和FNR对青霉素G酰化酶基因表达的影响

青霉素G酰化酶的表达受多种因素的调控。利用crp和fnr基因缺陷型菌株研究了葡萄糖阻遏和氧调控的机制。结果表明：FNR对pac表达不起调控作用,CRP对pac基因表达有正调控作用．并且CRP的结合位点位于结构基因上游的DNA序列上。随后,测定结构基因上游调控区的DNA序列,发现可能的CRP蛋白结合位点的同源保守序列为TGTGA。     

鸡β-肌动蛋白第一内含子对EIAV转移载体外源蛋白表达能力的影响

以马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）基因转移载体pcPPTWPRE为基础,用含不同长度片段的鸡β-肌动蛋白启动子替换原有的人巨细胞病毒立即早期启动子（CMVIEp）启动外源基因的表达,分别构建了2个基因转移载体,含部分第一内含子的pWCAGP0.8和含全长内含子的pWCAGP1.6。连同在其它研究中构建的不含内含子的质粒pcPPTWCAG（另文发表）,采用磷酸钙法分别转染HEK293细胞和DF-1细胞, 利用荧光显微镜观察报告基因eGFP蛋白的表达。并利用流式细胞仪定量。统计学分析结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8和 pWCAGP1.6表达阳性率分别为47.9%、46.1%和23.8%,转染后48h,收获细胞,利用流式细胞仪比较转染细胞中EGFP表达阳性细胞的百分率。结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8 和pWCAGP1.6的阳性细胞分别占计数细胞的47.9%、46.1%和23.8%;在DF-1细胞中,依次分别为12.4%、9.5%和4.2%,pcPPTWCAG与pWCAGP1.6差异显著。本研究表明不含内含子的EIAV载体质粒表达EGFP的能力高于含部分和全长内含子的载体。     

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85 %以上     

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85 %以上     

真核mRNA3′非翻译区的肿瘤抑制功能和表达调控

最近几年来 ,关于真核mRNA 3′UTR在肿瘤细胞恶性表型抑制中作用的研究 ,取得了非常令人鼓舞的进展 .目前已经发现 ,3′UTR参与一些已知的癌基因和抗癌基因的功能调控 ;一些抗癌基因的失活来源于其 3′ UTR的结构变化 ;而且又发现了一些基因的 3′UTR在转染恶性细胞后表现抗癌基因活性 .此外 ,3′UTR在mRNA表达调控中的作用也已研究得更加深入 .现将最近几年来在这一领域的一部分研究进展情况 ,作一简单综述     

真核mRNA 3′非翻译区的肿瘤抑制功能和表达调控

最近几年来,关于真核mRNA 3′UTR在肿瘤细胞恶性表型抑制中作用的研究, 取得了非常令人鼓舞的进展. 目前已经发现,3′UTR参与一些已知的癌基因和抗癌基因的功能调控; 一些抗癌基因的失活来源于其3′-UTR的结构变化;而且又发现了一些基因的3′UTR在转染恶性细胞后表现抗癌基因活性. 此外,3′UTR在mRNA表达调控中的作用也已研究得更加深入.现将最近几年来在这一领域的一部分研究进展情况,作一简单综述.     

猪血清白蛋白基因5′-端调控区的克隆与分析

根据已报道的hsa(人血清白蛋白基因)启动子的序列设计了一对引物,以猪的基因组DNA为模板,采用PCR扩增出一条256 bp的DNA链,用Primer Premier5.0和Promoter ScanⅡ软件进行分析。结果表明,此序列为psa基因5′-端上游调控区,该区域含有一般启动子的CAAT-box、TATA-box等基本的顺式作用元件。另外,还含有CTF/NF-1,CTF,APF,HNF-1, CP1等转录因子的结合位点。     

苏云金芽胞杆菌CcpA蛋白对几丁质酶基因chiA和chiB的表达调控作用

【目的】研究苏云金芽胞杆菌Bti75中糖代谢蛋白Ccp A对两种几丁质酶基因chi A和chi B的表达调控。【方法】利用PREDetector软件分析Bti75 chi A和chi B的基因上游区序列,EMSA方法在体外验证Ccp A是否能与chi A和chi B基因的启动子区域片段特异性结合。构建ccp A基因敲除载体以获得敲除突变株Δccp A,运用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术比较有无葡萄糖存在的情况下,Ccp A对chi A和chi B基因表达的影响。【结果】计算机分析显示,chi B上游启动子区存在一个潜在的Ccp A结合位点crechi B,而chi A上游启动子区未发现类似序列。体外实验表明,Ccp A蛋白在共阻遏蛋白Hpr-Ser45-P的参与下可与chi B基因启动子区特异性结合,而与chi A基因启动子区没有特异性结合;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,Bti75中ccp A基因敲除后,同样在葡萄糖存在下chi B的表达量提高而chi A的表达量变化不明显。【结论】在葡萄糖存在的情况下,Ccp A蛋白能抑制苏云金芽胞杆菌中几丁质酶chi B的表达,而chi A的表达不受Ccp A调控。