表达人肝再生增强因子肝细胞系生物人工肝治疗安全性的动物实验初步研究

目的：评价表达人肝再生增强因子基因的HepG2细胞系的细胞培养上清及细胞裂解物的小鼠急性毒性和近期致瘤性。方法：SPF级昆明种小鼠18只,随机分为空白对照组、细胞培养上清组、细胞裂解物组,每组小鼠各6只,腹腔分别接种空白培养液、细胞培养上清、细胞裂解物0．5ml。连续14天,每天观察记录动物毒性反应,14d后宰杀小鼠,取血测血生化指标。及观察病理改变。结果：各组小鼠均存活。除对照组1例小鼠,细胞培养上清组1例小鼠,细胞裂解物组2例小鼠次日活动稍减少外,均未见异常反应。血液生化检测ALT、AST、AFP、TBIL无明显异常,且各组间无差别。普通光镜下各组动物肝脏病理切片染色均未见明显异常。结论：目的细胞系细胞培养上清、细胞裂解物对实验用昆明小鼠无明确毒副作用及短期致瘤性。可能提供一种安全的可用于生物人工肝新的细胞来源。     

生物人工肝研究和应用进展

人工肝支持系统是用来为肝衰竭患者提供体外肝脏功能支持的技术方法.非生物人工肝在已经广泛应用肝衰竭患者的临床治疗,生物人工肝(BAL)以分离的哺乳动物肝细胞构成的生物反应器为解毒系统,可有效替代肝脏的解毒功能和合成功能,并可预防肝性脑病、肝昏迷和脑水肿.可作为肝移植前的过渡辅助,同时改善患者自身肝脏的功能以利于其功能的恢复.本文主要对生物人工肝的研究及应用进展进行综述.生物人工肝研究虽然取得了重大进展,但仍然面临寻找理想肝细胞来源,长期维持肝细胞的活性和功能,进一步优化反应器设计等问题.     

用于体外人工肝支持系统的肝细胞研究

目前,人工肝支持系统正在成为急性肝衰竭患者体外有效的肝支持治疗手段,其中以生物人工肝为主附加血或血浆灌流组成的体外组合型人工肝辅助装置最为人们关注,主要包含肝酶类、肝细胞成分、肝组织片及培养肝细胞系统等,其中又以对肝细胞培养系统的研究最为广泛。本文综述了国内外有关肝细胞的来源、培养方式、所需肝细胞数量等问题的研究进展。     

人肝再生增强因子在大肠杆菌中的高效表达及生物学活性研究

将人肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ亚克隆于表达质粒ｐＢＶ－２２０,构建了高效表达菌株,其特异表达蛋白占细菌可溶性蛋白的２０％,表达产物在体内具有促进肝细胞ＤＮＡ合成和提高ＣＣｌ４致中毒性肝功能衰竭大鼠存活率的作用。     

人肝再生增强因子CXXC活性结构域的研究

人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration, hALR)蛋白序列中有一段保守的Cys-Xaa-Xaa-Cys (CXXC)氨基酸序列,针对hALRp的CXXC结构,对hALR分别进行C65A和Q88C突变,表达、纯化突变体蛋白。体外检测hALRp和突变体的黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)辅助的巯基氧化酶活性,hALR-FAD和hALRQ88C-FAD组与对照组比较有显著差异(P<0.05),hALR-FAD和hALRQ88C-FAD组之间无差异;hALRC65A-FAD组与对照组比较无差异。结果显示,通过C65A突变将CXXC结构破坏后,该突变体的巯基氧化酶活性完全丧失;通过Q88C突变增加一个CXXC序列后,该突变体的巯基氧化酶活性较hALR-FAD未见明显增加;同时,FAD不仅是hALRp发挥巯基氧化酶活性必须的辅助因子,而且有助于hALRp突变体蛋白的复性。     

重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体DNA的保护作用

目的:初步探讨重组人肝再生增强因子(rhALR)保护及改善梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的机制.方法:144只健康wistar大鼠随机分为SHAM组,BDO-RBF组,BDO-RBF-rhALR组,利用荧光定量PCR方法,对各组大鼠肝细胞总mtDNA、缺失型mtDNA进行相对定量检测.结果:胆道梗阻后,肝细胞线粒体总mtDNA拷贝数出现明显下降(P<0.01).BDO-RBF-rhALR组总mtDNA拷贝数下降程度明显低于BDO-RBF组(P<0.05);对于缺失型mtDNA占总mtDNA的百分比,在SHAM组,未检测出缺失型mtDNA,而在BDO-RBF组及BDO-RBF-rhALR组,均可见缺失型mtDNA,BDO-RBF组的缺失型mtDNA占总mtD-NA的百分比明显高于BDO-RBF-rhALR组(P<0.05);在胆道梗阻解除后,BDO-RBF-rhALR组的总mtDNA的拷贝数及缺失型mtDNA修复速度明显快于BDO-RBF组(P<0.05).结论:rhALR可通过保护及修复梗阻性黄疸大鼠肝细胞受损的mtDNA,达到保护及改善梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的目的.     

人肝再生增强因子在大肠杆菌中的高效表达及生物学活…

将人肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ亚克隆于表达质业ＰＢＶ－２２０,构建了高效表达菌株,其特异表达蛋白占细菌可溶性蛋白的２０％,表达产物在体内具有促进肝细胞ＤＮＡ合成和提高ＣＣｌ４致中毒性肝功能衰竭大鼠存活率的作用。     

大亚湾人工鱼礁附着生物的初步研究

1988年8月至1989年7月在大亚湾鱼礁区进行附着生物调查研究,记录79种生物,大约有82.7％的生物种类是鱼礁区鱼虾的饵料生物(包括35种不带壳和32种带壳的饵料生物),有17.3％的生物种类为非饵料生物。礁区附着生物种类多,附着量大,生长迅速,投礁半年后100％被生物覆盖,附着厚度30mm,附着量达17.487kg/m~2。礁区生物一年四季都能繁殖附着,主要附着期4—10月,高峰期7、8、9三个月,是投礁的最佳时间。     

人胎肝中肝细胞生长因子生物活性的研究

人胎肝细胞裂解液经膜超滤,在分子量10～30kD组分中可检测出人肝细胞生长因子(hHGF)活性。hHGF为一热稳定的蛋白质或多肽类物质。它可特异地刺激肝来源细胞~3H-TdR掺入的增加,并且存在量效依赖关系,而对非肝来源细胞的DNA合成无刺激作用。hHGF的生物活性及理化性质与某些已知因子,如胰岛素、胰高血糖素、血小板来源的生长因子、表皮生长因子及增殖刺激因子等有所不同。     

肝再生增强因子的cDNA克隆、表达及表达产物的生物活性研究

以肝部分切除后再生肝组织为起始材料,利用RT-PCR扩增出大鼠肝再生增强因子（ALR）,亚克隆于pGEM-T载体,核苷酸序列测定证实为大鼠ALR;将ALRcDNA亚克隆于pBV220质粒,构建了原核表达栽体,并获高效表达菌株,特异表达蛋白占细菌总蛋白的15％,原核表达的ALR在体外缺乏促进大鼠原代培养肝细胞及SMMC-7721肝癌细胞DNA合成的活性,但在体内1／3肝部分切除模型中可刺激肝细胞DNA合成;ALR在生物学活性方面与肝脏刺激物（HSS）存在一定差别,ALR和HSS应是两种不同的活性因子．ALR还具有促肝损伤修复的作用,对其深入研究可能为临床治疗严重肝病提供有效的药物.     

Present and Future Developments in Hepatic Tissue Engineering for Liver Support Systems

The liver is the most important organ for the biotransformation of xenobiotics, and the failure to treat acute or acute-on-chronic liver failure causes high mortality rates in affected patients. Due to the lack of donor livers and the limited possibility of the clinical management there has been growing interest in the development of extracorporeal liver support systems as a bridge to liver transplantation or to support recovery during hepatic failure. Earlier attempts to provide liver support comprised non-biological therapies based on the use of conventional detoxification procedures, such as filtration and dialysis. These techniques, however, failed to meet the expected efficacy in terms of the overall survival rate due to the inadequate support of several essential liver-specific functions. For this reason, several bioartificial liver support systems using isolated viable hepatocytes have been constructed to improve the outcome of treatment for patients with fulminant liver failure by delivering essential hepatic functions. However, controlled trials (phase I/II) with these systems have shown no significant survival benefits despite the systems’ contribution to improvements in clinical and biochemical parameters. For the development of improved liver support systems, critical issues, such as the cell source and culture conditions for the long-term maintenance of liver-specific functions in vitro, are reviewed in this article. We also discuss aspects concerning the performance, biotolerance and logistics of the selected bioartificial liver support systems that have been or are currently being preclinically and clinically evaluated.     

骨形成蛋白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡

目的 构建表达重组人骨形成蛋白7 （bone morphogenic protein 7, BMP7）基因的重组逆转录病毒,观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性,并探讨其作用机制。方法 克隆BMP7基因,以loxP同源重组法构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP7（pLLBMP7）,转染包装细胞PT67进行病毒包装并测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,MTT法检测细胞生长变化,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;Western blotting检测BMP7,caspase-3和bcl-2蛋白表达。结果 重组逆转录病毒载体pLLBMP7经鉴定连接正确,转染PT67细胞后上清液中可得到病毒,滴度达1×109pfu;MTT检测见pLLBMP7病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（35.1% vs. 5.3%,68.5% vs.18.3%,均p<0.05）,48h可见BMP7蛋白高表达。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,于转染48h后达最高峰,其凋亡百分率高达14.42%;BMP7蛋白高表达时caspase-3蛋白的表达亦有显著升高,但bcl-2蛋白未见表达差异。结论 构建了BMP7逆转录病毒,在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡,其可能是通过激活caspase-3而发生作用。     

重组[B18Ile]人胰岛素的鉴定和特征

突变体「Ｂ１８Ｉｌｅ」猪胰岛素前体经分离纯化,转肽,得到重组「Ｂ１８Ｉｌｅ」人胰素「Ｂ１８Ｉｌｅ」人胰岛素能结晶,其与受体的结合能力为猪胰岛素的８２％,保留了与猪胰岛素基本相同的体内活力,从本文结果和分析表明Ｂ１８Ｖａｌ可能不是胰岛素表现生物功能所必需的。     

靶向survivin 的siRNA 联合5-FU 转染抑制肝细胞株HepG2 增殖的研究

目的:研究靶向survivin的(小分子干扰RNA)siRNA和(氟尿嘧啶)5-FU联用对肝癌细胞HepG2的增殖抑制及凋亡的影响。方法:将HepG2细胞分为空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组、siRNA转染组、5-FU+siRNA转染组。转染采用脂质体法。RT-PCR法检测HepG2细胞survivin mRNA转录水平;MTT法检测靶向survivin的siRNA和5-FU对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况。结果:空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组survivin mRNA表达无明显变化(P>0.05),siRNA转染组、5-FU+siRNA转染组survivin mRNA表达明显下降(F=280.326,q=4.72~7.34,P<0.05)。5-FU+siRNA转染组增殖抑制率为51.58%±1.35%,与其它各组相比抑制率明显增高(F=280.326,q=5.27~9.84,P<0.05)。5-FU+siRNA组与其它各组相比细胞凋亡率明显增高(F=13568.68,q=110.47～327.16,P<0.01)。结论:将靶向survivin的siRNA和5-FU联合应用可以显著抑制肝癌细胞survivin基因表达,并协同抑制HepG2细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用。     

靶向survivin的siRNA联合5-Fu转染抑制肝细胞株HepG2增殖的研究

目的：研究靶向survivin的（小分子干扰RNA）siRNA和（氟尿嘧啶）5-FU联用对肝癌细胞HepG2的增殖抑制及凋亡的影响。方法：将HepG2细胞分为空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组、siRNA转染组、5-FU＋siRNA转染组。转染采用脂质体法。RT-PCR法检测HepG2细胞survivinmRNA转录水平;MTT法检测靶向survivin的siRNA和5．FU对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况。结果：空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组survivinmRNA表达无明显变化（P〉0．05）,siRNA转染组、5-FU＋siRNA转染组survivinmRNA表达明显下降（F=280．326,q=4．72-7．34,P〈0．05）。5-FU＋siRNA转染组增殖抑制率为51．58％±1-35％,与其它各组相比抑制率明显增高（F=280．326,q=5．27-9．84,P〈0．05）。5-Fu＋siRNA组与其它各组相比细胞凋亡率明显增高（F=13568．68,q=110．47-327．16,P〈0．01）。结论：将靶向survivin的siRNA和5一Fu联合应用可以显著抑制肝癌细胞survivin基因表达,并协同抑制HepG2细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用。     

封闭EFNA2 基因表达对肝癌细胞HepG2 的转移和运动的抑制作用

目的:构建Ephrin-A2(EFNA2)基因的干扰RNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞HepG2转移能力的影响。方法:合成EFNA2基因的干扰RNA片段,用基因重组技术构建于腺病毒载体pAD-X,经293细胞包装得到高滴度重组腺病毒pAEFNA2/siRNA,并用real-time PCR进行EFNA2基因表达的验证。将重组腺病毒pAEFNA2/siRNA感染HepG2细胞,48h后用transwell小室法检测病毒对HepG2细胞侵袭和运动能力的影响。结果:经验证病毒正确构建,且HepG2细胞感染病毒pAEFNA2/siRNA后48小时的real-time PCR检测结果未见到有EFNA2基因的表达。病毒感染后transwell小室可见,HepG2细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制(分别为105±12 v.s.21±7cells/孔和194±22 v.s.39±11,P<0.01)。结论:成功构建了重组EFNA2siRNA腺病毒,并观察到封闭EFNA2对肝癌细胞HepG2的侵袭和运动均有抑制作用。     

Hepatic Deficiency of Augmenter of Liver Regeneration Exacerbates Alcohol-Induced Liver Injury and Promotes Fibrosis in Mice

Why only a subpopulation (about 15%) of humans develops liver cirrhosis due to alcohol is a critical as yet unanswered question. Liver-specific depletion of augmenter of liver regeneration (ALR) protein in mice causes robust steatosis and hepatocyte apoptosis by 2 weeks; these pathologies regress subsequently with return of ALR expression even at lower than control levels, but the mice develop modest steatohepatitis by 8 weeks. We aimed to investigate whether chronic alcohol ingestion promotes excessive hepatic fibrosis in these ALR-deficient mice. Liver-specific ALR-deficient and wild type (WT) female mice (8–10 weeks old) were placed on 4% alcohol-supplemented or isocaloric diet for 4 weeks. Liver sections were examined for histopathology, and parameters of steatosis and fibrosis were quantified. The mRNA expression of alcohol dehydrogenase-1, acetaldehyde dehydrogenase-1 and cytochrome P450-2E1 increased in WT mice but decreased in ALR-deficient mice upon alcohol ingestion. While alcohol induced steatosis and mild inflammation in WT mice, ALR-deficient mice showed minimal steatosis, strong hepatocellular injury and inflammation, prominent ductular proliferation, and robust fibrosis. Compared to the WT mice, alcohol feeding of ALR-deficient mice resulted in significantly greater increase in hepatic TNFα and TGFβ, and oxidative stress; there was also hepatic iron accumulation, robust lipid peroxidation and mitochondrial DNA damage. Importantly, similar to ALR-deficient mice, lower hepatic ALR levels in human alcoholic liver cirrhosis were associated with increased iron content, reduced expression of alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase, and elevated fibrogenic markers. We conclude that ALR deficiency or anomaly can play a critical role in alcohol-induced hepatic fibrosis/cirrhosis, mechanisms of which may involve dysregulation of alcohol metabolism and iron homeostasis, mitochondrial damage and oxidative injury.