转基因山羊在其乳汁中表达单克隆抗体

Genzyme Transgenics Corp(Framingham,MA)已证实,转基因山羊可在乳汁中产生复合单克隆抗体(MAb);该公司与Bristol-Myers Squibb Co.(BMS) (Princeton,NJ)签定一项协议,使养育在马萨诸塞州农场的这些转基因山羊表达BMS的抗癌BR96 Mab。 Genzyme Transgenic公司已经证实,可以在山羊乳汁中高水平表达人抗-凝集蛋白抗-凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。它还证明,如果按相同的遗传工程方法处理小鼠胚胎,转基因小鼠也可在其乳汁中产生     

Genzyme Transgenics公司用山羊奶生产药物

美国Genzyme Transgenics公司的研究人员在麻省乡村地区开发了168英亩土地及成群的健壮山羊,以此进行药物生产。据其所述,他们正在位于Charlton的农场中用转基因山羊生产至少2种治疗用蛋白及抗体。 该公司成功地繁殖出称为Grace的母山羊,并于近期为其庆贺生日。Grace是首次在实验室以外被繁殖出并发生遗传改变的动物。Genzyme公司寄希望于用Grace繁殖出在其乳汁中分泌单抗(Mab)BR96的山羊群。这种Mab是由Bristol-Moyers Squibb Co·开发,作用是将肿瘤治疗药物doxorubicin直接送至肿瘤部位。     

Genzyme创立美国首家转基因农场

Cenzyme Corp.的子公司Genzyme Transgenies.Crop.在伍斯特以外购买了166英亩农场,计划培育在其乳汁中表达人抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)及其它人蛋白的rDNA山羊。据该公司介绍,这是美国首家商品化转基因动物农场。 这家农场正在为来此的第一批山羊做准备,这批山羊将于今年夏天运达。此处可容纳1000只山羊,     

用山羊生产tPA

美国Tufts大学和Geozyme Transgenics Corporation的研究人员成功地诱导人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)在3只转基因山羊乳腺中发生早期表达。这是首次在家畜乳汁中产生tPA,并提供适宜今后成功地生产转基因药物的动物体。 在试验中,诱导8只转基因雌山羊(第一代转基因雄山羊交配产生的后代)在出生后第11～12个月时泌乳(比正常状态早1～7个月)。通过注射一系列雌激素和黄体酮完成上述过程。产生的乳汁含有浓度与初始转基因雌性动物相似(1～3mg/ml)的人长效组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(LAtPA)。对第一     

从1升山羊乳成功地分泌7克AT-Ⅲ

美国Genzyme Trangenies公司从1升重组山羊乳汁中以工业水平生产7克人抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。该公司决定作为以动物工厂生产的第一种医药品开发AT-Ⅲ,并着手工业化。去年11月已向美国食品与药物管理局(FDA)申报。为进入临床试验与FDA商谈重组AT-Ⅲ的安全性评价法和GMP标准(优良制造规范)等。     

转基因山羊

经过大约３年的时间,体细胞核移植技术从科学创新转入了扩繁生产医药的转基因动物的重要商品化阶段。Ｅｃｈｅｌａｒｄ及其同事描述了这一技术在山羊上的应用。利用转基因供体的胚胎细胞核成功地培育出了乳汁中分泌人抗凝血酶Ⅲ（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎⅢ）的无性系山羊。转基因山羊@孙雷心     

用小鼠生产人类胶原蛋白

Collagen Corporation公司已申请了一个在转基因动物奶中生产重组人类胶原蛋白的世界专利(WO94/16750,PCT)。GenPharm公司附属的欧洲子公司Gene Pharming Europe已与Collagen Corporation公司签定合同,生产出在其动物乳腺中表达人胶原蛋白并在其乳汁里分泌人胶原蛋白的转基因小鼠。目前,Collagen Corporation公司已投资160多万美元给GenPharm,以扩大其合同协议,使转基因奶牛奶液产生的人胶原蛋白商品化。这项投资有助于GenPharm公司在1994年期间提高资本800多万美元。     

人促红细胞生成素在转基因小鼠乳汁中表达

将山羊的β乳球蛋白启动子连接人促红细胞生成素基因,构建转基因表达载体。通过显微注射的方法转基因小鼠。经PCR斑点杂交和Southern杂交检测验证,获得4只转基因阳性小鼠,其中3只母鼠哺乳期收集乳汁,经EpoELISA检测为阳性。对4组转基因阳性小鼠的部分子代母鼠,经PCR和Southern杂交分析,又鉴定出6只获得遗传的阳性G1代母鼠以Dot-ELISA的方法检测,其中两只G1代母鼠乳汁中的Epo含量为0.5μg/mL。实验证实,867bp的β乳球蛋白启动子可以指导人促红细胞生成素在小鼠乳汁中表达。     

牛α-S1-酪蛋白-乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达

利用DNA重组技术．将牛α-S1酪蛋白调控区基因(16kh的片段)与乙肝表面抗原基因拼接,构建了融合基因表达构件：λ106。构件经转基因技术转入山羊受精卵。待受精卵发育至成熟个体并分娩、泌乳,ELISA检测其乳汁中的HBsAg,证明所构建的牛α-S1酪蛋白基因表达构件是可以在羊乳腺中表达乙肝表面抗原基因,并将其表达产物分泌到乳汁中。     

人类凝血第八因子转基因乳山羊的培育

台湾大学农学院研究人员应用显微注射技术 ,将含有牛α 乳白蛋白基因 (αlA)调节序列与人类凝血第八因子 (hFⅧ )基因构造性cDNA序列的αLA hFV Ⅲ转基因片段 ,注入小鼠和山羊的早期胚原核中 ,并将此二早期胚分别移植于受胚小鼠和受胚山羊的生殖道内 ,希望能获得转基因小鼠和转基因羔羊 ,还分别从其乳腺生产hFVⅢ的医药用蛋白质。开始试验移植 6 1 2只已完成αLA hFVⅢ基因注射的小鼠胚于 2 1只受胚母小鼠 ,结果 1 4只怀孕并产下79只小鼠。用PCR、Southernblot及slotblot分析结果 ,证实其中 1 7只 (1 0♀ /7♂ )系带有αlA hFVⅢ基…     

重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测

设计了以hSOD1、hSOD3为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动增强子构建乳腺特异性表达载体rhSOD1、rhSOD3,共转染母山羊胎儿成纤维细胞,采用PCR和扩增产物序列分析筛选获得SOD1/3克隆细胞株,应用体细胞核移植(SCNT)制备双转基因山羊。出生小羊经PCR和扩增产物序列分析验证是否成功整合外源基因,经Western blotting、ELISA及体外活性检来验证分析表达产物。结果表明:获得SOD1/3转基因山羊胎儿成纤维细胞系6株;原代双转基因体克隆山羊1只(♀);从该转基因羊乳汁中检测到rhSOD1、rhSOD3,浓度分别为:88.81±8.36 mg/L和267.82±12.67 mg/L;转基因羊乳汁中重组人SOD酶活性为1 432±157 U/mL。研究表明,以双载体和单标记基因转染山羊胎儿成纤维细胞可获得双基因整合转基因细胞系,并且以SOD1与SOD3功能基因均可在山羊乳腺中共同表达,表达产物具有较好的生物学活性。     

美利用转基因山羊生产抗癌药

美利用转基因山羊生产抗癌药据悉,美国马萨诸塞州ＧｅｎｚｇｍｅＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ公司已首次在世界上将单克隆抗体表达于山羊奶,显示了利用转基因山羊生产抗癌药物的可能性。这家公司利用转基因山羊的单克隆抗体生产能力为每升奶＆ｇ以上,相当于利用细胞培养生产...     

牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。     

牛α—S1—酪蛋白—乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达

利用ＤＮＡ重组技术,将牛α－Ｓ１酪蛋白调控区基因（１６ｋｂ的片段）与乙肝表面抗原基因拼接,构建了融合基因表达构件：λ１０６。构件经转基因技术转入山羊受精卵。待受精卵发育至成熟个体并分娩、泌乳,ＥＬＩＳＡ检测其乳汁中的ＨＢｓＡｇ,证明所构建的牛α－Ｓ１酪蛋白基因表达构件是可以在羊乳腺中表达乙肝表面抗原基因,并将其表达产物分泌到乳汁中。     

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建

目的：构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法：将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的5′端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3／3′LTR、牛生长激素（BGH）基因poly（A）依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果：酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论：为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

乳腺特异高表达人促红细胞生成素转基因奶山羊的制备

目的制备乳腺特异性高表达人促红细胞生成素（hEPO）转基因奶山羊。方法采用牛β-乳球蛋白基因（BLG）调控元件和hEPO全长编码序列基因组DNA构建真核表达载体,应用受精卵原核注射的方法制备hEPO转基因山羊。结果在原核注射获得的188头羔羊中,经Southern blot法检测有4头羊含有hEPO基因,其中3头为母羊,1头公羊于出生后20d死亡;3头转基因母羊hEPO基因的拷贝数分别为1、10、2;Western blot检测结果显示转基因羊乳中的hEPO分子质量为32kDa;MTT法检测结果表明,在泌乳10d的3只转基因羊乳汁中,每毫升乳汁中hEPO活性分别达到1.17×10^2IU、1.90×10^4IU、1.91×10^4IU。结论牛BLG能够调控hEPO基因在山羊乳腺中高表达,为实现其他药用蛋白在山羊乳腺中表达奠定了基础。     

高歇病糖蛋白可能会成为Genzyme公司的主要产品

Genzyme公司在近两年内可能会在市场出售一种用于治疗高歇病的葡糖脑苷脂酶。几年前,Genzyme与国立卫生研究院(NIH)合作,研制一种修饰型天然葡糖脑苷脂酶。Genzyme公司在相当长的时间里一直为NIH临床试验提供产品。年初,公司开始了一系列新的临床试验。如果食品和药物管理局(FDA)同意的话,Genzyme公司就获得该药的独立药物资格,给它专有的美国市场销售权。     

转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶III蛋白质(rhATIII)

利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶III(rhATIII)蛋白质。其中包括: 筛选出人的抗凝血酶Ⅲ蛋白基因的cDNA序列; 利用山羊的b－酪蛋白基因的启动区, 终止信号和Enterokinase蛋白酶酶切DNA序列, 构建在乳腺中特异表达rhATⅢ的表达载体。同时在转基因载体的末端连接一个新酶素筛选基因(Neomycin)。再以细胞转染、G418筛选和体细胞核移植(动物克隆)等过程, 最后获得含有人的抗凝血酶Ⅲ基因的转基因克隆奶山羊。我们共获得了5个原代转基因公羊。第一只克隆羊在出生后78 d死亡, 解剖表明: 羊的肺部和肾脏等器官有异常。其它克隆公羊经过与崂山种母羊交配, 得到转基因后代, 其中两个原代转基因羊的后代母羊已成熟、所获得的奶经蛋白质电泳证明: 转基因克隆羊后代奶中含有约60 kD大小的rhATⅢ糖蛋白; 经Elisa检测表明: 在奶中含有大量活性的rhATⅢ, 在来源于两个不同克隆公羊的后代母羊奶中的rhATⅢ含量分别为0.4 mg/L和3 g/L。此研究证明: 转基因奶山羊可以大量地生产具有很高活性的rhATⅢ。用这种方法生产的rhATⅢ通过蛋白质提纯, 制成注射针剂, 将可用于人的抗凝血酶III缺乏症的治疗、预防血栓和重大手术过程中的止血的作用等。     

抗凝血酶Ⅲ转基因山羊外源基因拷贝数及其蛋白表达量的测定

目的:检测抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)转基因山羊外源基因的拷贝数及ATⅢ蛋白的表达量,分析拷贝数与蛋白表达量的相关性。方法:用Primer 5.0软件设计外源基因ATⅢ及山羊管家基因GAPDH的引物,以倍比稀释的标准品进行实时荧光定量PCR,制作标准曲线,通过标准曲线计算外源基因拷贝数;通过酶显色底物法检测ATⅢ蛋白的含量。结果:依据ATⅢ和GAPDH基因标准曲线方程计算得到的山羊个体间外源基因的拷贝数相差很大,最少的为5,最多为25,且不同转基因山羊间ATⅢ表达水平的差别达10倍以上。结论:外源基因表达水平在受到拷贝数的影响外,也受到整合位点等其他因素的重要影响。     

转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶III蛋白质(rhATIII)

利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶III(rhATIII)蛋白质。其中包括: 筛选出人的抗凝血酶Ⅲ蛋白基因的cDNA序列; 利用山羊的b－酪蛋白基因的启动区, 终止信号和Enterokinase蛋白酶酶切DNA序列, 构建在乳腺中特异表达rhATⅢ的表达载体。同时在转基因载体的末端连接一个新酶素筛选基因(Neomycin)。再以细胞转染、G418筛选和体细胞核移植(动物克隆)等过程, 最后获得含有人的抗凝血酶Ⅲ基因的转基因克隆奶山羊。我们共获得了5个原代转基因公羊。第一只克隆羊在出生后78 d死亡, 解剖表明: 羊的肺部和肾脏等器官有异常。其它克隆公羊经过与崂山种母羊交配, 得到转基因后代, 其中两个原代转基因羊的后代母羊已成熟、所获得的奶经蛋白质电泳证明: 转基因克隆羊后代奶中含有约60 kD大小的rhATⅢ糖蛋白; 经Elisa检测表明: 在奶中含有大量活性的rhATⅢ, 在来源于两个不同克隆公羊的后代母羊奶中的rhATⅢ含量分别为0.4 mg/L和3 g/L。此研究证明: 转基因奶山羊可以大量地生产具有很高活性的rhATⅢ。用这种方法生产的rhATⅢ通过蛋白质提纯, 制成注射针剂, 将可用于人的抗凝血酶III缺乏症的治疗、预防血栓和重大手术过程中的止血的作用等。