基于Cre/LoxP系统的Smad2条件基因打靶小鼠的建立

Smads家族是转化生长因子TGF-b信号转导途径中一个重要的新基因家族.SMAD2属于受体激活的SMADs.Smad2基因在多种肿瘤中发生突变,是一种可能的肿瘤抑制基因. Smad2基因完全剔除导致小鼠在胚胎期6.5d死亡.为了研究Smad2在脊椎动物成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用,利用Cre/LoxP系统构建了Smad2条件基因打靶载体,将两个方向相同的LoxP序列置于编码SMAD2蛋白C末端功能域序列两侧的内含子中,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的功能;用打靶载体电击转染小鼠胚胎干细胞,经Southern杂交筛选到3株发生正确同源重组的中靶ES细胞克隆;通过囊胚显微注射将中靶ES细胞导入受体小鼠囊胚腔,获得了ES细胞种系嵌合体;对高嵌合度小鼠与C57BL/6J的子代小鼠进行基因型鉴定,成功地获得了Smad2条件基因打靶小鼠.     

Smad4介导转化生长因子-β信号调节骨骼发育和稳态维持的功能

转化生长因子-β（TGF-β）是一个包括数十种TGF-βs、骨形态发生蛋白（BMPs）等配体在内的生长因子超家族,在哺乳动物整体和组织器官发育过程中具有广泛而重要的功能。Smad4是细胞内TGF-β信号通路的核心信号转导分子。为了深入研究Smad4介导的TGF-β信号在骨骼发育过程中的生理功能,我们利用转基因技术研制了软骨细胞、肥大型软骨细胞和成骨细胞分别特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,利用条件基因敲除技术研制了不同类型骨骼细胞Smad4基因敲除的小鼠模型。表型分析结果揭示了Smad4在软骨细胞增殖和分化、骨重塑以及稳态维持过程中的功能以及相关的分子机制,为理解人类相关骨骼疾病的发生及其机理提供了新的线索。     

利用胚胎干细胞分化的拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有分化的全能性已经得到广泛共识。ES细胞在体外分化所形成的拟胚体在结构上能够模仿早期胚胎发育过程,包括在内细胞团表面形成内胚层、柱状上皮细胞的分化,以及中央空腔的形成。本文介绍利用拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程中各个胚胎阶段的发育、细胞程序性死亡的发生及TGF-β信号在胚胎发育过程中的作用。     

TGF-β信号通路介导的相关疾病及靶向治疗

TGF-β信号通路是一个由众多细胞因子组成的大家族,调节着包括细胞生长、上皮-间质转化、迁移、分化以及凋亡等在内的许多细胞功能,在组织与器官的正常生长、胚胎发育等过程中起着关键作用.一旦TGF-β信号传导过程发生异常,随之而来的就是一系列发育缺陷和疾病的产生,如肿瘤的发生,组织器官的纤维化,结缔组织以及骨骼疾病等.通过对TGF-β信号通路在不同疾病发生中的作用进行研究,目前已经开发了许多靶向此通路的治疗策略,如单克隆抗体、受体激酶抑制剂和反义寡聚核苷酸等.本综述总结了 TGF-β信号通路在不同疾病发生中的作用,并对最新的靶向此信号通路的治疗策略进行讨论.     

抑制型Smad对TGF-β信号通路的负调控研究进展

转化生长因子TGF-β超家族是一类在结构上相关的蛋白,目前发现在哺乳动物中有超过30多个细胞因子可能属于这一超家族。它们在各类细胞中广泛参与细胞生长、黏附、迁移、分化及凋亡等过程。其中抑制型Smad(I-Smads,包括Smad6和Smad7)是TGF-β/BMP信号通路里重要的抑制型蛋白,在多种细胞与组织的发育过程以及疾病的发生过程中扮演着重要的角色。对其研究已经过10多年,取得许多重大的进展,但也还有很多重要的问题还没有解决。着重介绍I-Smads对TGF-β信号通路的负调控研究进展。     

中药基于TGF-β/Smad信号转导通路调控肿瘤细胞

转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)是一类具有多种生物学功能的多肽类细胞因子,对细胞生长、分化发挥重要作用,与肿瘤的发生、发展具有十分密切的关系。Smads蛋白作为TGF-β信号转导通路下游重要的信号分子,可直接或与其他通路协同将TGF-β通路的信号从细胞外转导到细胞核内,调控TGF-β在细胞水平介导的多种生物学效应。我国抗癌药物研究中的大量资料表明,中药成分可以延缓肿瘤的发生进程,中药或其提取物可通过TGF-β1、Smads或其他效应因子影响TGF-β/Smad通路的信号转导从而调控肿瘤细胞的活动。本文就国内对中药成分基于TGF-β/Smad信号转导通路调控肿瘤细胞生长方面的研究进展予以综述。     

人诱导多能干细胞来源功能性胰岛β细胞的体外定向分化方法的建立

1型糖尿病是由胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足所致,目前,主要通过外源性胰岛素补充来治疗,但外源性胰岛素无法精准调控血糖,严重低血糖可危及生命。胰岛移植是一种替代疗法,但面临器官供体不足和异种来源胰岛β细胞存在人畜共患病交叉感染风险的问题。因此,获得足量且安全的胰岛β细胞是1型糖尿病细胞治疗面临的难题。本研究旨在通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)在体外向胰岛β细胞分化,提供一种潜在的1型糖尿病治疗新策略。为实现这一目标,我们采用了结合2D和3D培养系统的分化策略,模拟胰岛β细胞的体内发育环境,并使用多种生长因子调节在胰腺发育和β细胞分化中发挥重要作用的关键信号包括Notch信号通路(Notch signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β/Smad信号通路(TGF-β/Smad signaling pathway)等,在体外将hiPSC定向诱导分化至胰岛β细胞。结果显示,在2D、3D结合的培养条件下,分化过程中定型内胚层细胞,胰腺祖细胞,胰腺...     

Smad4基因在人卵巢癌高、低转移细胞系HO-8910和HO-8910PM中的表达及其对肿瘤转移作用的研究

转化生长因子β（transforming growth factor,TGF-β）超家族广泛存在于多种生物的各种组织中,参与细胞增殖分化、血管形成、肿瘤发生、细胞外基质形成等多种生物学事件。Smad4是TGF-t3／Smads信号通路中的关键分子,研究表明,Smad4的过表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和细胞外基质的合成并诱导凋亡。本实验利用人高低转移性卵巢癌细胞系HO-8910PM和HO-8910细胞系作为对象通过基因转染技术过表达Smad4,     

FGF8在脊椎动物早期胚胎发育中的调控作用

成纤维细胞生长因子8 (fibroblast growth factor 8,FGF8)是成纤维细胞生长因子家族的成员之一,是一种组织发育过程中的重要分泌性调控信号分子,参与脊椎动物的多种组织器官的发生与发育.早期胚胎细胞通过表达FGF8在组织和器官发育、血管发生、血细胞生成、附肢发生和伤口愈合等方面发挥着重要作用.FGF8不但可以在细胞外通过胞内信号通路,而且也可以进入细胞内部发挥生物学功能.本文就FGF8在脊椎动物神经系统、内脏器官、肢体发育及不对称发育等组织、器官发育中的调控作用予以阐述.     

小鼠胚胎干细胞体外发育分化模型

胚胎干细胞 (Embryonicstemcell ,EScell)是多潜能性细胞 ,它在体外既可维持不分化而无限增殖 ,又能参与胚胎发育分化为各种类型细胞和组织而形成器官 ;小鼠ES细胞可供的数量大、在体外培养条件可进行精确调控、实验比较经济加上现代基因及其他生物操作等技术 ,因此小鼠ES细胞体外发育分化系统被广泛地作为模型系统加以利用。小鼠ES细胞体外发育分化研究为推动其他哺乳类动物以及人的ES细胞研究 ,从而将更好地进行细胞、组织工程实验为人类细胞组织和基因治疗服务创造了有利条件。本文将ES细胞体外发育分化情况加以概述 ,以便更好地开展ES细胞体外研究     

Smad7对Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用

研究人永生化支气管上皮BEP2D细胞中,作为Smad蛋白家族的抑制分子,Smad7对TGF-β信号通路中Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用.培养BEP2D细胞,瞬时转染Smad7真核表达载体pCISmad7.neo,TGF-β刺激,提取细胞核蛋白及总蛋白,用Western blot方法比较瞬时转染Smad7基因前后细胞核中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达的差异.结果,Smad3在TGF-b作用下有明显的核转位;转染Smad7后Smad3、Smad4的核转位显受到抑制.表明在BEP2D细胞中,Smad7对TGF-β/Smads信号通路的拮抗作用主要通过抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4异源复合物的形成及核转位,从而拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应.     

BPOZ基因纯合缺失ES细胞系的建立及其生长和分化研究

研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状态.利用3种基因型ES细胞进行细胞生长曲线和3H胸嘧啶核苷参入实验比较其生长速度和增殖能力.以裸鼠荷瘤实验和类胚体形成实验比较BPOZ基因纯合缺失型ES细胞与野生型ES细胞生长分化能力.结果表明,筛选获得两个BPOZ基因剔除的纯合ES细胞克隆;筛选得到的纯合ES细胞中BPOZ基因表达完全缺失,细胞处未分化状态.与野生型ES细胞相比,BPOZ基因纯合缺失型ES细胞生长受抑,增殖能力减弱.BPOZ基因纯合缺失型ES细胞可分化形成类胚体和具备来自3个不同胚层的细胞和组织的畸胎瘤.BPOZ基因剔除使ES细胞生长受抑,对ES细胞分化发育没有明显影响.     

卵巢癌中TGF-β/Smads信号通路的功能研究

为探讨卵巢癌细胞中TGF-β的信号传导情况及TGF-β／Smads信号通路各组分在卵巢癌发生中的作用,采用MTT和活细胞计数方法研究了TGF-β1对卵巢癌细胞系HO-8910、HO-8910PM及SKOV3的生长抑制作用;并应用RT-PCR、荧光免疫组化等方法研究了TGF-β／Smads传导通路中各组分的表达和定位以及TGF-β1刺激前后Smad7和P-Smad2定位及表达的变化。结果显示,TGF-β1对细胞系SKOV3没有生长抑制作用．而SK-OV3细胞表达了TGF-β／Smads信号通路中的所有已知成分。且3种卵巢癌细胞在TGF-β1刺激后Smad7mRNA瞬时表达增加,Smad7蛋白表达亦增加并由胞核转位到胞浆,P-Smad2由胞浆转位到胞核。结果表明TGF-β／Smads信号传导通路在卵巢癌细胞HO-8910、HO-8910PM和SKOV3中是完整的,SKOV3细胞逃逸TGF-β介导的生长抑制作用可能是由于TGF-β／Smads信号通路下游发生异常。     

转化生长因子β通过Smad4非依赖的方式促进赖氨酰氧化酶的表达

目的:研究血管平滑肌细胞内转化生长因子β(TGF-β)信号怎样调节赖氨酰氧化酶(LOX)的表达。方法:分离小鼠原代血管平滑肌细胞,用携带不同Smad4干扰序列的慢病毒感染原代细胞,建立Smad4敲低稳定细胞系;分别用TGF-β刺激原代细胞或对照和Smad4敲低细胞,利用免疫印迹及Real-time PCR技术检测Smad4敲低后LOX的表达改变。结果:获得了Smad4敲低的细胞;TGF-β能诱导LOX表达,且在Smad4敲低的细胞内,LOX升高更明显。结论:TGF-β通过Smad4非依赖的方式促进LOX的表达。     

TGF-β/Smad信号通路在肾小球硬化模型中表达的意义

目的:通过观察在肾小球硬化动物模型中TGF-β、Smad2和Smad7蛋白和mRNA表达的意义,了解TGF-β/Smads信号通路在肾小球硬化中的作用.方法:制备肾小球硬化动物模型,检测24小时尿蛋白定量、血浆白蛋白及血尿素氮水平,观察肾组织形态学改变;免疫组织化学检测TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白水平;荧光定量PCR检测TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的水平结果:TGFβ1、Smad2和Smad7正常情况下普遍在肾小球系膜细胞、肾小管上皮及间质细胞中有少量表达;模型组4周时TGFβ1和Smad2蛋白表达增加,Smad7蛋白表达下降;6～8周时TGF-β1和Smad2蛋白表达明显增加,Smad7蛋白表达明显下降.模型组4周时TGF-β1和Smad2 mRNA出现表达上调,6～8周TGF-β1和Smad2 mRNA表达明显增加.4周时Smad7 mRNA表达下调,6～8周Smad7 mRNA表达明显下降.模型组与对照组比较有显著性差异(p＜0.01).结论:TGF-β/Smad信号通路参与了肾小球硬化的纤维化进程,Smad7是TGF-β/Smad信号通路抑制性调控因子,可能为治疗肾小球硬化提供治疗手段.     

Smad2条件基因剔除载体的构建及LoxP位点有效性鉴定

Smads家族是最新发现的TGF－β信号转导途径中一个重要的新基因家族,SMAD2属于受体激活的SMADs。Smad2在某些肿瘤中发生突变,是一种可能的肿瘤抑制基因。Smad2基因完全剔除小鼠在胚胎期E6．5天死亡,为了研究Smad2在成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用,构建了Smad2条件基因剔除载体,将LoxP置于Smad2基因组序列C末端功能域两侧,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的功能,该载体的构建为进行Smad2组织特异性基因剔除研究了奠定了基础。     

转染Smad7基因的人Tenon囊成纤维细胞Smad2及Ⅰ型胶原蛋白表达的改变(简报)

大量研究表明,TGF-β作为一种具有多种功能的生长因子,是全身瘢痕愈合的重要刺激因素.在人眼部参与多种眼部纤维化的过程。尤其在促进青光眼滤过术后结膜瘢痕形成中起重要作用。Smad蛋白家族在TGF-β超家族的信号转导中具有重要的作用。Smad7主要通过抑制TGF书受体介导的Smad2、Smad3磷酸化来拮抗TGF-β的信号转导,被认为是TGF-β超家族信号转导自我调节的一种负反馈信号。     

BPOZ基因剔除小鼠模型的建立

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因,建立BPOZ基因剔除小鼠模型,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列,设计基因剔除策略,构建完成了基因剔除载体XpPNT-BPOZ.以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得抵抗克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆.将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只,其中15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠,阳性率为50%.在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠.初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常,有繁殖能力,进一步的表型分析工作正在进行之中.     

TGF-β1/Smad 2/3信号通路在椎间盘退变中的作用

临床实践表明,富含血小板的血浆(PRP)注射是延缓椎间盘退变的有效方法,但其作用机制尚不清楚。已有研究表明,活化的血小板可释放转化生长因子-β1 (TGF-β1),它可以正向调节髓核细胞的细胞外基质。本研究旨在揭示TGF-β1/Smad 2/3信号通路在PRP缓解椎间盘退变过程中的作用机制。本研究通过制备新西兰白兔PRP,并使用PRP和TGF-β1抑制剂(SB431542)处理白兔髓核细胞,检测PRP对髓核细胞增殖、软骨形成标志物(CollagenⅡ和Aggrecan) m RNA的表达、Smad 2/3及相关髓核细胞功能蛋白表达的影响。结果显示,用2%PRP处理的髓核细胞的增殖显著增强。PRP处理显著增加髓核细胞中的CollagenⅡ和Aggrecan的mRNA水平。Western blotting结果显示,TGF-β1信号通路的特异性抑制剂可显著抑制Smad 2/3和基质蛋白的表达。在兔椎间盘退变模型中,PRP+抑制剂注射组的Smad 2/3和CollagenⅡ的表达水平显著低于PRP处理组。这些结果表明,PRP中由于TGF-β1含量高,可激活TGF-β1/Smad 2/3途径,并促进CollagenⅡ和其他基质成分的合成和分泌,从而延缓了椎间盘退变。     

器官的构造是如何形成的——以果蝇翅为例

在器官发育过程中,细胞是如何接收到指令,在特定的位置形成特定的细胞形貌,来组建一个正确的三维构造实现器官的功能,这是生物学中的最基本问题之一。在发育的早期,选择者基因通过赋予细胞以不同的亲和性把组织划分为若干个隔间区域。隔间边界细胞作为组织者通过分泌信号分子(器官成形素)来促进细胞的存活和增殖,控制细胞的分化和命运,以及确保正确的细胞形貌发生。器官成形素的空间时序性表达以及随后细胞对这些信号分子的反应是正确形成组织构造的关键环节。根据国际最新的研究进展,本文综述了构造形成的机制和主流假说,并以果蝇翅的发育为例,讨论了TGF-β家族器官成形素Dpp在翅发育中的作用机制。