牦牛HORMAD1基因的克隆及生物信息学分析

利用分子克隆技术获得了牦牛HORMAD1基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等方面进行了预测和分析.结果表明,牦牛HORMAD1基因包含一个长度为1 182 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸;其编码蛋白属于亲水性蛋白,无明显的信号肽,含有很多个磷酸化位点.二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主.HORMAD1基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛HORMAD1与黄牛、马和猪等物种的HORMAD1氨基酸遗传距离较近,具有高度相似性.     

商陆高亲和性K＋转运体基因PaHAK1的克隆与表达分析

为了研究高钾植物商陆高亲和性K＋吸收机制,本试验选用野生商陆为材料,以拟南芥、冰叶日中花、小麦、大麦和水稻等多种植物的HAK家族基因的保守序列,设计简并引物,获得了981bp的PaHAK1的基因片段。然后应用RACE技术克隆到PaHAK1基因序列,其cDNA全长为2337bp,编码771个氨基酸。该编码蛋白质分子量为86．66kDa,等电点为7．54。蛋白质疏水性和拓扑结构分析显示该氨基酸序列共有12-13个跨膜区。该cDNA序列与冰叶日中花HAK1基因序列相似性高达88％。Real-TimePCR分析表明PaHAK1主要在商陆根中表达,低钾状态可以诱导PaHAK1的高表达。     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

Bt新型基因sip的克隆、表达和生物信息学分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白对农业害虫有特异的杀虫活性,对环境无污染、对人畜无害,成为目前为止研究和应用最为广泛的生物杀虫剂.其中内毒素(insecticidal crystal proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)研究范围广、技术成熟,而分泌期杀虫蛋白(Secreted insecticidal protein,Sip)相关报道较少.为进一步发掘我国苏云金芽胞杆菌的菌株资源和新型基因资源,从不同生态环境中分离出400株Bt野生菌株进行sip基因的克隆鉴定,其中Bt野生菌株QZL26扩增得到1 038 bp的碱基的序列,编码345个氨基酸,与Sip1A蛋白氨基酸序列同源性为91.83％.测序结果提交GenBank注册,登录号为JQ965994.     

水稻硒结合蛋白基因OsSBP的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻硒结合蛋白(selenium-binding protein, SBP)基因的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa Japonica)为材料,采用同源克隆法获得Os SBP,并对其进行组织特异表达及生物信息学分析。结果表明,Os SBP基因cDNA序列为1 623 bp,包括长度为1 449 bp的CDS,碱基组成为A 23.3%、T 25.1%、G 28.9%、C 22.6%,编码482个氨基酸残基组成的蛋白质。Os SBP蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位Os SBP主要分布在细胞质中,推测可能在运载结合、辅助因子中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在24个丝氨酸磷酸化,11个苏氨酸磷酸化位点和10个酪氨酸磷酸化位点以及6个糖基化位点。启动子元件分析表明,其含有与热胁迫、干旱胁迫、光反应、细胞防御、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信号传导相关元件。进化分析结果表明,克隆的Os SBP氨基酸序列与短柄草、高粱的同源关系较近,具有较高的保守性,与莱茵衣藻的同源关系较远。RT-PCR分析结果表明,Os SBP基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和根,穗中表达量最低,且该基因的表达受Cd,盐和热的诱导,以及PEG和Cold的抑制。该基因的成功克隆及分析为进一步研究Os SBP在水稻抗逆中的作用奠定了重要的基础。     

青杄中sPPa1的cDNA序列克隆及其生物信息学分析

以青杄(Picea wilsonii)均一化cDNA文库为模板,通过RACE方法克隆得到青杄PPa1基因cDNA全长,对该cDNA序列、核苷酸序列的相似性、理化性质、疏水性、二级结构、三级结构及是否跨膜进行了分析预测;进行了多序列比对并构建了系统树,同时对PPa1在青杄各组织中的表达量进行了检测.结果表明:青杄PPa1基因共由216个氨基酸组成,分子量为24.55 kD,理论PI为5.83,属可溶性蛋白;二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲和β-折叠构成;PPa1在青杄花粉中表达量最高.研究为进一步研究青杄PPa1的功能奠定了基础.     

水稻纹枯病菌Rspg1基因的克隆、表达及其编码产物生物信息学分析

【目的】为克隆、表达水稻纹枯病菌Rspg1基因,明确其编码产物的生物学特性,为研究该基因在病菌致病过程及与寄主互作中的作用提供理论依据。【方法】据GenBank提供的相关序列设计特异引物扩增目的基因,并对之进行原核表达和生物信息学分析。【结果】从水稻纹枯病菌基因组DNA中扩增出一1395 bp的目的片段。RT-PCR分析表明,该片段为Rspg1基因的完整开放阅读框,含有5个内含子(278-334,57 bp;545-601,57 bp;657-715,59 bp;1090-1155,66 bp;1244-1304,61 bp),编码区为1 095 bp,编码一含有364个氨基酸的蛋白。原核表达Rspg1基因,表达产物大小约为40 kDa,具明显的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)活性,活性值为277.78 U/mg。生物信息学分析表明,RsPG1中含有所有生物PG特有的严格保计序列180NTD、202DD、223GHG和255RIK,存在一18个氨基酸的信号肽分子;二级结构以α-螺旋、β-折叠和随机卷曲为其基本结构单元,6个半胱氨酸残基形成3个二硫键,跨膜结构预测以从胞内向胞外分泌为主;三级结构为10个重复的β-折叠环按右手螺旋规则排列形成的螺旋结构,形成一个开放的有活性的裂隙结构。【结论】Rspg1基因编码产物为一40 kDa蛋白,具明显的PG(Polygalacturonase,PG)活性,以胞外分泌为主,且有一个开放的有活性的裂隙结构。     

人Aurora B基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

目的:克隆出人AuroraB基因,并将其于大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达,获得重组蛋白.方法:利用TRIzol Reagent 法提取食管癌ECa 109细胞总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增Aurora B基因,构建pET 28a(+)-Aurora B重组质粒,将其转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG体外诱导表达重组蛋白.利用生物信息学工具对Aurora B的核酸序列和蛋白功能结构进行分析.结果:成功构建了pET 28a(+)-AuroraB重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人Aurora B基因序列同源性达到了99％;获得AuroraB蛋白,大小约39kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的28％.结论:对人AuroraB基因进行克隆、原核表达及生物信息学分析,为深入研究Aurora B在细胞周期调控中的作用机制及后续Aurora B抑制剂的体外筛选奠定基础.     

牛Pbx-1基因的电子克隆及生物信息学分析

新基因全长cDNA序列很难获得,但电子克隆却提供了基因克隆的一种策略.利用小鼠Pbx-1基因编码序列(NM_183355)为种子序列进行电子克隆获得牛Pbx-1基因完整编码序列.然后,用生物信息学方法分析了牛的Pbx-1基因的结构,密码子偏性和氨基酸的同源性等.结果表明:该基因cDNA全长1 754 bp,无内含子,最大开放阅读框1 305 bp.编码434个氨基酸.预测其编码的蛋白分子量为47 189.5 Da,与小鼠的同源性为81%.     

毕氏海蓬子SbDREB基因的克隆与表达分析研究

以毕氏海蓬子的基因组为模板,通过PCR技术扩增到一个编码DREB蛋白AP2保守结构域的基因片段;根据该片段序列设计引物,以毕氏海蓬子经NaCl处理的植株肉质茎cDNA为模板,应用RACE技术获得该基因的cDNA全长,命名为SbDREB(GenBank登录号:JF894301)。SbDREB基因cDNA全长1206bp,包含一个编码284个氨基酸的完整开放阅读框。对氨基酸序列比对分析表明,该蛋白在靠近N端具有典型的AP2/EREBP保守结构域,且该结构域与一些高等植物DREB类转录因子的AP2区域具有高度同源性。进化树分析表明SbDREB属于DREB亚家族中的A-6亚族。实时荧光定量PCR结果显示:干旱、高盐和ABA能够诱导其表达,而低温则使其表达下调,表明该基因在毕氏海蓬子植株对干旱、盐和低温等非生物胁迫的应答中起作用。     

北美海蓬子SbNHX1基因耐盐性及功能结构域分析

对从北美海蓬子中分离的Na+/H+逆向转运蛋白基因SbNHX1进行了耐盐性及功能结构域分析.利用套叠PCR技术去除SbNHX1基因C末端162个核苷酸,得到SbNHX1-C基因,然后将SbNHX1、SbNHX1-C和拟南芥Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AtNHX1分别插入pET22b(+)表达载体,转化大肠杆菌B菌株,进行各种金属盐离子胁迫分析.结果表明,北美海蓬子Na+/H+ 逆向转运蛋白基因SbNHX1只对Na+ 、K+离子有抗性,且耐盐性强于拟南芥Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AtNHX1.缺失C末端的SbNHX1-C基因对Na+、K+离子胁迫无抗性,说明北美海蓬子Na+/H+ 逆向转运蛋白基因SbNHX1的耐盐作用与该基因C末端1 353 bp至1 514 bp的序列密切相关.     

草莓果实钾载体蛋白基因的克隆与序列分析

本文用RT-PCR的方法,首次从草莓幼果RNA中成功扩增出KUP/HAK/KT转运体基因的部分序列,经过克隆测序得到了1个长度为1252bp基因片段,编码416个氨基酸.经过与其他物种KUP/HAK/KT转运体基因序列比较相似率在70%～78%之间,氨基酸相似性在72%～88%之间.草莓KUP/HAK/KT转运体基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及草莓钾元素营养代谢分子水平上的研究及果实品质的改良打下坚实的理论基础.     

大鼠高亲和力二羧酸转运蛋白的克隆表达及细胞内定位

目的：克隆大鼠高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白（SDCT2）的全长cDNA,并明确其在肾小管上皮细胞内的定位表达情况。方法：从大鼠肾组织中提取总RNA,用带有8肽FLAG标签的PCR引物通过RT-PCR技术扩增出SDCT2全长基因并测序,将其插入真核表达载体中构建SDCT2真核表达载体,然后将它们转染到肾小管上皮细胞LLC-PKl中表达,并用激光共聚焦显微镜观察该蛋白的亚细胞定位情况。结果：扩增出2kb的SDCT2全长基因,Westernblot表明肋CT2基因在LLC-PKl细胞中得到了正确的表达;共聚焦显微镜分析显示正常SDCT2蛋白主要定位于细胞膜上,与生物信息学的预测结果一致;为了比较不同连接温度对重组DNA连接效率的影响,观察了3种连接温度下的转化效率,结果显示温度循环法的连接效率明显比其他2种常规连接温度要高。结论：高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白全长基因被成功克隆,其主要表达于肾小管上皮细胞膜上。     

马铃薯硝态氮转运蛋白基因的克隆及表达分析

该研究以马铃薯双单倍体‘DM’为材料,克隆到高亲和性硝态氮转运蛋白基因StNRT2.1的全长cDNA(JGI登录号PGSC0003DMT400002924),并对其进行表达模式和生物信息学分析,为深入探索StNRT2.1基因的生物学功能以及提高马铃薯对氮素的利用效率奠定理论基础。结果表明:(1)通过同源克隆与PCR扩增获得StNRT2.1基因cDNA全长片段,并构建pCEGFP-StNRT2.1表达载体;测序结果显示其实际所编码的蛋白质序列与数据库中目的基因蛋白质序列完全一致,表明成功克隆到StNRT2.1基因且未出现错义突变。(2)StNRT2.1基因位于马铃薯第11号染色体,cDNA序列全长1 593 bp,编码530个氨基酸,预测蛋白相对分子质量约为57.60 kD,理论等电点为9.36。(3)生物信息学分析显示,StNRT2.1由20种氨基酸组成,其中甘氨酸(Gly)所占比例最多,达到10.8%,并且主要由228个α-螺旋、27个β-折叠、87个延伸链和188个无规则卷曲构成;StNRT2.1存在功能保守结构MFS_1(PF07690)和12个跨膜螺旋结构域,且N端和C端均位于细胞膜内; StNRT2.1位于质膜上且不具有信号肽,可能为非分泌型膜蛋白。(4)以氮充足(7.5 mmol/L)水平作为对照,马铃薯幼苗经无氮(0 mmol/L)和低氮(0.75 mmol/L)处理3周后呈现出叶片发黄及植株矮化等明显表型差异。(5)qRT-PCR结果显示,在无氮条件下,马铃薯根组织中StNRT2.1基因表达量升高3.98倍,说明StNRT2.1可能为诱导型高亲和转运蛋白。     

Effect of Salinity upon Cell Membrane Potential in the Marine Halophyte, Salicornia bigelovii Torr

The electrophysiology of root cells of the marine halophyte, Salicornia bigelovii Torr., has been investigated. Cellular concentrations of K⁺, Cl⁻, and Na⁺ and resulting cell membrane potentials were determined as functions of time and exposure to dilutions of artificial seawater. Treatment of these data by the Nernst criterion suggests that Cl⁻ is actively transported into these root cells, but that active transport need not be invoked to explain the accumulation of Na⁺ at all salinities investigated nor for K⁺ at moderate to high salinities. In low environmental salinity, the cell electropotential of Salicornia root cells was found to respond to inhibitors in a fashion similar to that observed in glycophytes; in high environmental salinity, root cell membrane potential appears to be insensitive to bathing salinity and m-chlorocarbonylcyanide phenylhydrazone induces membrane hyperpolarization, in contrast to the response of glycophytes to such treatments. The fact that measured membrane potentials exceed diffusion potentials for Na⁺, K⁺, and Cl⁻ and the observation of a rapid depolarization by CO in the dark suggests an electrogenic component in Salicornia root cell membrane potentials.     

九台晚李PGIP基因的克隆及生物信息学分析

以九台晚李叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长1192bp的目的片段(GenBank登录号:GU068978)。该基因包含有1个完整的开放阅读框,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长990bp,编码330个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列分析表明:该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等李属植物的PGIP基因序列一致度达95%~99%。系统进化分析显示出属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特点。该序列为植物分子抗病育种提供了1条新的基因资源。     

沙冬青脯氨酸转运体基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从沙冬青中克隆获得了脯氨酸转运体基因Am Pro T(Gen Bank登录号为KJ873133)。序列分析表明,Am Pro T基因开放阅读框为1 329 bp,编码442个氨基酸,预测蛋白质分子量为48.07 k D,等电点为9.32,含有11个跨膜区域,具有典型的脯氨酸转运蛋白的特征。进化分析显示,Am Pro T与大豆Pro T的相似性达到86%。荧光定量PCR分析表明,Am Pro T在地上部的表达量要显著高于地下部,在受到干旱、高盐、脱落酸胁迫后表达量呈上调趋势,推测Am Pro T可能在沙冬青响应干旱、盐等非生物胁迫过程中发挥作用。