辣根过氧化物酶标记抗体在免疫定位上的应用 Ⅱ.肝细胞内乙型肝炎表面抗原的电子显微镜定位方法

本文介绍辣根过氧化物酶标记抗体对肝细胞内乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的免疫电镜定位方法。电镜样品制备,可采用酶标免疫显色组织切片的再包埋、或直接利用超薄切片进行酶标免疫显色定位。对实验中应注意的一些问题进行了讨论。在电子显微镜下初步观察了HBsAg 阳性肝细胞中HBsAg 的分布和形态,并发现在光学显微镜下,辣根过氧化物酶标免疫定位HBsAg 完全为阴性部位的肝细胞中,有的细胞胞浆内或扩大的内质网池内,尚可见到少量散在的HBsAg 与酶标抗体的沉积物,提示电镜观察有更好的灵敏性。     

非线性光学显微镜观察肝脏纤维化的实验研究

目的:了解非线性光学显微镜在肝纤维化成像及定量分析研究中的地位。方法:分别用前向二次谐波(SGH)及背向双光子荧光(TPEF)对肝脏标本的成纤维胶原(Ⅰ/Ⅲ)和肝细胞浆进行成像,将结果与传统的Masson’s三染色法进行比较。随后用非线性光学显微镜对不同肝纤维化阶段的大鼠肝脏标本成像,并对图像进行统计分析。结果:(1)用二次谐波成像的肝内成纤维胶原分布图较传统的方法更清晰,易于进一步定量分析;(2)双光子荧光信号可以清晰的显示肝细胞形态;(3)非线性光学显微镜得到的肝纤维化图像易于用软件进行定量分析。结论:非线性光学显微镜是研究肝纤维化进程的灵敏、准确、快速、简单、客观的新方法。其对肝纤维化的定量分析具有重要临床意义。     

硫酸铝钾对小鼠肝损害的实验研究

本文主要观察硫酸铝钾——饮用水净化剂引致小鼠肝酶组化,超微结构和组织结构的变化。动物30只,分为正常组、硫酸铝钾大、小剂量组。实验结果:硫酸铝钾10mg/kg/日(大剂量组)与5mg/kg/日(小剂量组)动物用药10天、80天均可使肝SDH酶活性降低;肝细胞线粒体肿胀、嵴断裂和溶解。在光学显微镜下用药80天后大部分肝细胞肿胀,胞浆疏松淡染、肝小叶内可见呈小灶状分布的炎性细胞浸润,主要为淋巴细胞及浆细胞,门管区偶见少许炎性细胞,但肝小叶和门管区未见结缔组织增生。为此,硫酸铝钾作为净水剂,不宜用量过大。     

免疫酶技术及其对副流感病毒(仙台株)抗原的定位观察

采用辣根过氧化物酶标记抗体的方法,对副流感病毒(仙台株)抗原在组织细胞内的繁殖部位进行了光学显微镜和电子显微镜的观察。在受病毒感染的小鼠肺切片上,多数细支气管上皮细胞及部分肺泡细胞胞浆内呈明显阳性;在体外实验中,受感染的单层人胚肾细胞的胞桨膜、胞浆膜表面的病毒颗粒以及部分胞浆均可见阳性反应。此外,本文还对结果的特异性,酶标记技术中抗原的固定,酶与免疫球蛋白的结合以及酶标记抗体进入组织细胞等方法学问题进行了一些探讨。     

一种同时分离培养大鼠肝细胞及肝枯否细胞技术的建立

目的:建立简便、经济的同步分离培养肝细胞及kupffer细胞的方法.方法:采用肝脏原位灌洗结合离体胶原酶灌注消化的方法获得总细胞悬液,差速离心分离肝细胞及肝非实质细胞,经多次低速离心可分离肝细胞,经percoll密度梯度离心以及选择性贴壁法得到纯化的kupffer细胞.台盼蓝染色鉴定细胞活力.使用倒置相差显微镜、HE染色、PAS染色及白蛋白免疫组织化学染色对培养肝细胞的形态及功能进行检测.使用光学显微镜、荧光显微镜及CD68免疫荧光染色鉴定分离的kupffer细胞.结果:体外成功的同步分离培养了肝细胞及kupffer细胞,肝细胞产率为1.37± 0.53× 108/大鼠,kupffer得率为3.45± 0.41×106/g肝脏.细胞存活率及纯度都可达90％.肝细胞培养24h后呈典型肝细胞形态,7天后仍具有糖原合成和白蛋白合成能力.贴壁后的kupffer细胞呈典型的星型或三角形,且其标志分子CD68免疫荧光染色阳性.结论:应用改良的原位灌注方法可以很好的同时分离具有活性及功能的肝细胞和kupffer细胞.     

激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较

激光扫描共聚焦显微镜在活细胞的动态检测、光学切片和三维结构重建等方面较光学显微镜有质的飞跃。本文对激光扫描共聚焦显微镜和光学显微镜进行了比较和讨论,并简单介绍多光子激光扫描显微镜。     

大鼠部分肝切后血清对体外培养肝细胞的刺激作用

目的探讨大鼠部分肝切后血清对体外培养肝细胞生长状况的影响。方法对Sprague-Dawley大鼠进行肝部分切除,分别在术后第12、24、36h于心腔内穿刺取血,制备刺激血清。采用酶消化法分离获取Sprague-Dawley乳鼠的肝细胞,在加有10％上述刺激血清的DMEM培养基中进行肝细胞体外培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,采用免疫细胞化学方法检测肝细胞中白蛋白和纤维蛋白原的表达情况。结果发现在肝切后血清刺激作用下,原代培养的肝细胞生长加快,存活时间增长。细胞传代培养后仍用制备血清加以刺激,可产生胶原样细胞外基质,并且在基质上粘附的肝细胞呈现克隆样生长状态,其胞浆内白蛋白和纤维蛋白原均呈阳性表达。结论研究初步表明,体外培养乳鼠肝细胞时加入大鼠部分肝切后血清,可以有效刺激细胞的生长,促进细胞外基质的产生,从而利于肝细胞在体外较长时间存活、增殖和功能保持,同时此种肝细胞体外培养方式还为肝脏细胞生物学研究增添了新的实验途径。     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

慢性丙型肝炎肝细胞及细胞器病变特点研究

目的观察不同炎症程度的丙型肝炎肝细胞及细胞器超微结构,了解不同炎症程度的丙型肝炎患者肝细胞超微结构特征。方法收集6例经肝穿刺活检病理确诊的轻度、中度、重度丙型肝炎肝组织标本各2例,同时选取2例肝移植中的正常供肝组织作为对照,对照光镜特点,对各病例电镜下的肝细胞器超微结构特点进行分析总结。结果光镜下观察到轻度慢性丙型肝炎以肝细胞水肿变性为主;中度慢性丙型肝炎以汇管区炎症为主伴淋巴滤泡形成;重度慢性丙型肝炎肝小叶内易见肝细胞点状坏死,纤维组织增生并可见弓形纤维或假小叶形成。电镜下观察到与正常肝细胞相比较,轻度慢性丙型肝炎病例中肝细胞胞浆内粗面内质网减少、滑面内质网增多;中度慢性丙型肝炎表现为肝细胞胞浆内脂滴稍增多,部分伴脂滴融合,胞浆内局灶可见胶原纤维;而重度慢性丙型肝炎的肝细胞内可见线粒体凝聚、融合和变性,糖原增多,脂滴进一步呈大泡型脂变并融合,细胞核内可见包涵体形成。结论不同炎症程度的丙型肝炎肝细胞具有不同的超微结构特征。     

显微镜下物体大小的测量

人类对微观世界的认识与光学显微镜的发明是分不开的 ,随之而产生的光学显微镜技术是我们进一步认识微观世界的重要手段。尽管在近代科技突飞猛进的今天 ,人们已能利用电子显微镜对更细微的结构进行观察 ,但光学显微镜仍然是当前生物学研究的重要的基本工具 ,光学显微镜技术还是生物学教学和研究的重要手段。虽然光学显微镜分辩二点间的距离不能小于照明光波波长的一半 ,一般大于 0 .2μm,但在分辩范围内 ,我们利用它可以观察到肉眼看不见的物体 ,如微生物、动植物的组织、细胞 ,部分细胞器和诸如纤维之类非细胞形态结构等。由于光学显微镜…     

激活T细胞的培养上清液对肝癌细胞毒性作用的电镜观察

外周血液E-玫瑰花环阳性的淋巴细胞由PHA-P刺激而产生无白细胞介素-1(Interleukin-1)的培养上清液,在体外对大鼠肝癌细胞的杀伤效应敏感,通过光学显微镜观察,激活T细胞培养上清液引起肝癌细胞胞浆的收缩、分离。电子显微镜观察这些细胞显示出溶酶体残留的致密小体形成和线粒体肿胀,细胞浆内以及贴邻的细胞膜之间出现大量空泡。这种现象提示了激活T细胞培养上清液有侵袭肝癌细胞的特性,导致细胞溶解。     

人、猪、鼠血管内皮及平滑肌细胞培养与纯化方法的改进

对培养和纯化猪主动脉内皮细胞,人脐静脉内皮细胞,猪和鼠主动脉平滑肌细胞的方法进行改进。对其鉴定方法进行了讨论,用胶原酶或胰酶消化法,或机械法分别从猪主动脉,人脐静脉,鼠主动脉获得内皮细胞和平滑肌细胞进行培养,用光学相差显微镜,免疫组化的方法进行鉴定,结果显示,相差显微镜观察,人脐静脉内皮细胞接种后2-3小时贴壁,继而铺开生长,在视野内形成散在细胞团,细胞呈铺路石样排列的单层,随着传代次数增多,可见核分裂,双核及多核,猪血管内皮细胞呈鹅卵石样,多角形,生长分裂旺盛时可见两个或多个核,猪和鼠的平滑肌细胞在相差显微镜下外观为长梭形,细胞生长致密时排列成束,相互平行,并且重叠生长,表现为典型的“波峰”与“浪谷”状。猪血管内皮细胞DiI-Ac-LDL染色,在荧光显微镜下显示特征性的黄绿色荧光,人Ⅷ因子抗原免疫组化检测人脐静脉内皮细胞,显微镜下可见核周胞浆呈现阳性反应,免疫组织化学法进行平滑肌细胞α-肌动蛋白染色,显微镜下见细胞浆内着色,本介绍的培养及纯化猪血管内皮细胞,猪平滑肌细胞,鼠平滑肌细胞的方法简便易行。     

人喉癌裸鼠移植瘤模型的建立及部分生物学特性研究

用人喉癌手术切除标本建立了裸鼠移植瘤模型,已传至13代。原代移植成功率为66.7％,潜伏期30～70d;鼠间传代移植成功率为100％,潜伏期14～19d,生长稳定。经光学显微镜检查,各代移植瘤组织结构与原人喉癌组织基本一致。电镜检查证明,具有人喉癌特征,癌细胞间有大量桥粒,细胞浆中可见张力原纤维,有的张力原纤维与桥粒相连。细胞表面有较大的指状突,核膜较规则,胞浆中线粒体较多。     

EHFV感染NIH裸鼠抗原定位研究

探讨流行性出血热病毒（ＥＨＦＶ） 感染ＮＩＨ裸鼠抗原在各脏器的分布情况, 观察其分布规律。经裸鼠腹腔注射ＥＨＦＶ液, 裸鼠发病后, 濒死状态处死, 进行免疫组织化学、电镜和光学显微镜观察。感染ＥＨＦＶ 的裸鼠其肺、脑、肾、肝、心脏和脾组织细胞内均检测到特异性抗原, 抗原主要分布于细胞胞浆, 以高尔基器及其周围囊泡较多。ＥＨＦＶ 感染ＮＩＨ裸鼠,病变可广泛侵犯其各组织器官, 抗原主要分布于相应组织器官实质细胞胞浆内, 导致细胞损伤     

伞菌孢子的扫描电镜研究*

本文研究了8科35种伞菌孢子在光学显微镜和扫描电子显微镜下的孢壁纹饰,提出伞菌孢子纹饰的一些基本类型,井澄清在光学显微镜下曾被误解的某些种类的孢子纹饰。     

伞菌孢子的扫描电镜研究

本文研究了8科35种伞菌孢子在光学显微镜和扫描电子显微镜下的孢壁纹饰,提出伞菌孢子纹饰的一些基本类型,井澄清在光学显微镜下曾被误解的某些种类的孢子纹饰。     

天然抗氧化剂丹参酮Ⅱ—A对肝细胞脂质过氧化产物与DNA相互作用的影响

［＾３Ｈ］花生四烯酸标记的肝细胞,经ＦｅＣｌ２－ＤＴＰＡ启动脂质过氧化后,细胞ＤＮＡ出现放射性,并随保温时间增加而逐渐增高,表明在细胞内脂质过氧化产物与ＤＮＡ发生相互作用,生成了一种ＤＮＡ加成物,经测定它具有特征荧光光谱,显示较低的增色效应和Ｔｍ值。用高度敏度荧光图象显微镜直接观察发现丹参酮Ⅱ－Ａ经细胞摄取后主要滞留在细胞膜与胞浆中。它能有效地抑制细胞脂质过氧化,减少脂质－ＤＮＡ加成物的产生,并阻     

伊曲康唑对皮肤癣菌形态学影响研究

目的观察皮肤癣菌在伊曲康唑作用下的形态学变化。方法应用美国CLSI制订的标准M38-A方案进行伊曲康唑对皮肤癣菌的体外药敏试验,测定最小抑菌浓度（MIC）,将伊曲康唑作用前后的皮肤癣菌分别制成标本,在光学显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察形态学变化。结果伊曲康唑作用于皮肤癣菌后,在光学显微镜下菌丝变得弯曲、短粗,顶端和局部出现膨大;扫描电子显微镜下菌丝变得弯曲、短粗、干瘪,顶端和局部出现膨大,有不规则分支,表面粗糙,有大小不等的凹陷;透射电子显微镜下菌丝变得皱缩,有凹陷,双层细胞壁结构消失或不完整,细胞膜不连续,皱缩细胞膜和细胞壁之间及胞浆内出现许多小的高电子密度颗粒,细胞器也变得不清晰。结论伊曲康唑使皮肤癣菌的形态发生明显变化。     

应用原位杂交及免疫组化检测肝活检组织中流行性出血热病毒RNA及抗原

本文应用原位杂交及免疫组化技术对25例流行性出血热(EHF)患者肝活检组织进行了病毒RNA及其囊膜G_2蛋白的定位检测,结合光镜,认为肝细胞的变性、胞浆疏松化、点状坏死是EHF病毒直接侵犯并在其胞浆内增殖表达所致,肝组织的灶状坏死则主要是肝窦狭窄、枯否氏细胞增生导致微循环障碍引起的缺血性梗死。急性脂褐素沉积是病毒侵犯肝细胞的间接证据。研究还发现,肝细胞内病毒的多少与病程关系不明确,而与临床分型有一定相关,为探讨EHF的发病机制提供了分子水平的依据。     

数码显微镜DIY及应用探讨

数码显微镜相对于光学显微镜而言,在观察效果、指示效果、图像记录、实验效率等方面均有很大的优点。作者利用现有的光学显微镜和一般的电脑摄像头,经过组装与调试,DIY成了完全可以实用的数码显微镜。并提供了作者在实际应用中总结的一些经验：如硬件和软件的选择与使用,图像的显示、指示、捕获、存储及动态摄像等。