微生物多样性的研究方法概况

介绍了进行微生物多样性研究多种方法,将其简要划分为三大部分：1．经典纯培养技术的改进方法;2．现代分子生物学技术;3．上述两种方法的联合使用;并重点阐述了这些方法的优缺点,展望了微生物多样性研究方法的发展前景。     

免培养法对大鲵肠道微生物多样性的研究

【目的】了解大鲵肠道内生细菌的组成及多样性。【方法】采用美国Mo Bio公司试剂盒提取大鲵肠道内容物总DNA,选用细菌通用引物799F和1492R对总DNA进行16S rRNA基因特异性扩增,构建大鲵肠道内容物内生细菌16S rRNA基因克隆文库,对阳性克隆进行限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,并对HaeⅢ酶切带谱不同的菌液进行测序,构建系统发育树。【结果】根据酶切带谱分析和测序结果的不同,将随机挑取的101个阳性克隆归为28个不同的可操作分类单元(OTUs),系统发育分析表明这些克隆序列分别属于变形菌门(Proteobacteria)、梭菌门(Clostridia)、芽孢杆菌门(Bacilli)和衣原体门(Chlamydiae)4个门。其中,变形菌门(Proteobacteria,占克隆总数的92.08%)为最优势类群。序列比对结果表明这些克隆序列分别与已报道的20个属具有较高的相似性。此外,还有一个OTU在系统发育树上形成独立分支且未能确定其分类。【结论】大鲵肠道内生细菌多样性丰富,并且可能存在新的分类单元。     

朱鹮肠道微生物多样性与产酶活性

【背景】朱鹮是我国国家一级保护动物,属于世界上最濒危的鸟类之一。对朱鹮肠道微生物的多样性和产胞外酶活性进行分析,可为朱鹮种群数量恢复提供思路。【目的】了解朱鹮肠道微生物的多样性,测定其产胞外酶活性。【方法】采用纯培养的方法获得朱鹮肠道微生物,通过革兰氏染色和生理生化鉴定,结合16S rRNA基因扩增和序列分析对细菌进行鉴定。使用水解圈法筛选产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶的菌株。【结果】从人工喂养的朱鹮新鲜粪便中共分离到296株细菌,共计2个门11个属。变形菌门(Proteobacteria) 236株,占分离总数的79.73%,分别为：埃希氏菌属(Escherichia) 137株,占分离总数的46.28%;哈夫尼亚菌属(Hafnia) 39株,占分离总数的13.18%;变形菌属(Proteus) 28株,占分离总数的9.46%;柠檬酸杆菌属(Citrobacter) 23株,占分离总数的7.77%;气单胞菌属(Aeromonas) 6株,占分离总数的2.03%;肠杆菌属(Enterobacter) 1株,占分离总数的0.34%;志贺菌属(Shigella) 1株,占分离总数的0.34%;克雷伯菌属(Klebsiella) 1株,占分离总数的0.34%。厚壁菌门(Firmicutes) 60株,占分离总数的20.27%,分别为：肠球菌属(Enterococcus) 33株,占分离总数的11.15%;库特氏菌属(Kurthia) 14株,占分离总数的4.73%;芽孢杆菌属(Bacillus) 13株,占分离总数的4.39%。优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)中的埃希氏菌属(Escherichia),占细菌总数的46.28%。经过生理生化鉴定,每个菌株生理生化鉴定出的种属与各自的16S rRNA基因鉴定出的种属相一致。产酶活力分析结果显示有238株产蛋白酶、25株产脂肪酶、24株产淀粉酶、15株产纤维素酶,分别占分离总数的80.41%、8.45%、8.11%和5.07%。【结论】朱鹮肠道微生物分离出的细菌可分为2门11属,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)中的埃希氏菌属(Escherichia),占细菌总数的46.28%;产酶活性分析显示,80.41%的菌株具有产蛋白酶能力。     

宿主肠道微生物群落多样性和演替分析技术的演变和发展

人或动物等宿主肠道内定植有大量微生物。但是,宿主肠道内微生物的多样性和演替一直被认为是人和动物营养研究中的黑箱（black box）。经过科学家几个世纪的研究已证实：正常微生物群是一个新的人体生理学系统;肠道微生物菌群参与宿主对营养素的消化、吸收与合成;刺激其免疫机制。近年又发现：微生物群影响宿主基因表达,可进行微生物与宿主之间的“分子对话”,例如：一个人肥胖或者苗条的倾向可能部分是由生活在肠道中的微生物群体的组成所决定的（戈登,2005）。可见,肠道微生物是未来微生态科学极其重要的研究领域。对于肠道微生物群落的分析方法主要有沿用已久的传统培养法和近年来兴起的基于基因序列的微生物分子生态学方法。     

珠江口野生棘线鲬胃肠道微生物多样性

【背景】野生棘线鲬(Grammoplites scaber)具有丰富的营养价值,但关于其胃肠道微生物方面的研究较少。【目的】研究棘线鲬胃肠道微生物群落特征,以揭示其潜在的益生菌和致病菌,为其健康生长的微生物群落调控提供依据。【方法】利用免培养和纯培养技术相结合的方式对来自珠江口的野生棘线鲬胃肠道样品进行了研究。【结果】通过对16S rRNA基因V3区高通量扩增测序,共得到456个操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)。分析结果显示,在门水平上,棘线鲬胃肠道内的主要优势类群为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。在属级水平上,梭菌属(Clostridium)在棘线鲬胃肠道样品中普遍存在,综合占比为57.11%。基于16S rRNA基因进行表型和功能预测的结果表明,棘线鲬胃肠道内有益菌和潜在致病菌同时存在且有功能相互制约的趋势。纯培养实验采用12种不同的培养基进行选择性分离,共获得纯培养菌株99株,归类于3个门(Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria) 4个纲10个目10个科13个属,其中优势类群为变形菌门(占比50.51%),实现纯培养最多的属级类群为嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。【结论】揭示了野生棘线鲬胃肠道微环境微生物的物种组成与多样性,可以为硬骨鱼类核心肠道菌群的研究提供基础参考。此外,有益和有害菌群的揭示可为野生棘线鲬作为海洋食物资源利用的食品安全提供一定的借鉴,为发展海洋渔业养殖提供数据支撑。     

热应激环境下蛋鸡肠道微生物菌群多样性

通过分析热应激环境下蛋鸡肠道菌群结构的变化,旨在揭示热应激对肠道微生态环境的影响机理,为探索炎热环境下家禽肠道菌群定植规律提供理论依据。试验选择16周龄济宁百日鸡96只,随机分成对照组[(24±1)℃,Ⅰ]和热应激[(38±1)℃]组,分别在2个人工环境气候舱中饲养,各组设6个重复,每个重复8只,试验持续14 d。采用16S rDNA的变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术和实时荧光定量(Real-time quantitative RT-PCR)以及多变量统计(Principal Components Analysis,PCA)分析等手段,分析热应激2d(Ⅱ)、7d(Ⅲ)和14 d(Ⅳ)时,对十二指肠、空肠及回肠内容物菌群多样性以及菌群数量变化。PCA分析结果显示,热应激暴露过程中十二指肠部位菌群组成与对照组保持相似的趋势,但热应激2 d时空肠部位菌群组成有分开趋势;到7 d时空肠与回肠部位菌群组成分开明显,而14 d时菌群组成具有明显差异;热应激7、14 d时空肠和回肠部位末检测到敏感乳杆菌(Lactobacillus agilis),回肠部位也末检测到约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、不可培养细菌(Uncultured bacterium)等芽孢杆菌纲,而热应激不同时间段空肠和回肠部位可检测到不可培养细菌(Uncultured Escherichia sp)、溃疡拟杆菌(Bacteroides helcogenes)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)和索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)等拟杆菌纲和γ-变形菌纲;其中约氏乳杆菌、敏感乳杆菌数量变化在空肠部位减少最明显(P0.05),空肠和回肠卵形拟杆菌、不可培养的拟杆菌数量明显上升(P0.05)。热应激环境下蛋鸡空肠、回肠部位菌群多样性较为丰富,其抑制乳杆菌属、不可培养细菌的增殖,促进卵形拟杆菌的繁殖,而促进卵形拟杆菌的繁殖,导致消化道菌群平衡的破坏。     

玫瑰高原鳅肠道微生物多样性研究

研究旨在分析玫瑰高原鳅(Triplophysa rosa)肠道微生物的结构组成和多样性,探索其肠道微生物的潜在功能。提取了5尾玫瑰高原鳅的肠道总DNA,运用Illumina Miseq平台对肠道微生物16S rRNA的V3—V4区进行了测序,统计样品肠道微生物的操作分类单元(Operational Taxonomic Units, OTUs)数量,分析物种组成、丰度及Alpha多样性,并预测肠道微生物的功能。结果显示,玫瑰高原鳅的肠道微生物有19门、31纲、87目、146科、253属、 320种, 451个OTUs。在门水平上,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes);在属水平上,优势菌群为气单胞菌属(Aeromonas)、爱德华菌属(Edwardsiella)、邻单胞菌属(Plesiomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella)。功能预测表明,肠道微生物编码的大多数基因与新陈代谢相关,其中"碳水化合物运输和代谢"和"氨基酸转运与代谢"功能类群的相对丰度较高。玫瑰高原鳅肠道内微生物组成复杂,...     

肠道微生物与慢性病

肠道微生物在长期进化过程中与人类形成了共生关系,对人类的生理代谢、生长发育、免疫应答和对疾病的抵抗力、衰老等,都起着不可忽视的作用,它们影响着每个人的健康.最新的研究进展表明,结构异常的肠道菌群很可能是肥胖、高血压、糖尿病等慢性病的直接诱因.     

人体肠道微生物多样性和功能研究进展

人体肠道中庞大而复杂的微生物群落对人体自身代谢表型有深远的影响.肠道微生物群落在亚种或菌株水平上表现出极大的多样性.利用微生物分子生态学、元基因组学和代谢组学研究方法,发现肠道微生物与宿主表现出共进化的特点,肠道微生物群落及其基因组为宿主提供了互补的遗传和代谢功能,表现出互惠共生关系.但是,肠道微生物群落中影响宿主代谢表型的关键功能菌鉴定及其作用模式问题仍然悬而未决,综合运用多种高通量研究方法和多维数据分析方法可能成为解决这个问题的突破口.     

Characterization of the microbial diversity in a permafrost sample from the Canadian high Arctic using culture-dependent and culture-independent methods

A combination of culture-dependent and culture-independent methodologies (Bacteria and Archaea 16S rRNA gene clone library analyses) was used to determine the microbial diversity present within a geographically distinct high Arctic permafrost sample. Culturable Bacteria isolates, identified by 16S rRNA gene sequencing, belonged to the phyla Firmicutes, Actinobacteria and Proteobacteria with spore-forming Firmicutes being the most abundant; the majority of the isolates (19/23) were psychrotolerant, some (11/23) were halotolerant, and three isolates grew at -5 degrees C. A Bacteria 16S rRNA gene library containing 101 clones was composed of 42 phylotypes related to diverse phylogenetic groups including the Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Cytophaga - Flavobacteria - Bacteroides, Planctomyces and Gemmatimonadetes; the bacterial 16S rRNA gene phylotypes were dominated by Actinobacteria- and Proteobacteria-related sequences. An Archaea 16S rRNA gene clone library containing 56 clones was made up of 11 phylotypes and contained sequences related to both of the major Archaea domains (Euryarchaeota and Crenarchaeota); the majority of sequences in the Archaea library were related to halophilic Archaea. Characterization of the microbial diversity existing within permafrost environments is important as it will lead to a better understanding of how microorganisms function and survive in such extreme cryoenvironments.     

土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养

土壤微生物群落多样性是土壤微生物生态学和环境科学的重点研究内容之一.传统的土壤微生物群落多样性解析技术是指纯培养分离法(平板分离和形态分析法以及群落水平生理学指纹法).后来,研究者们建立了多样性评价较为客观的生物标记法(磷脂脂肪酸法和呼吸醌指纹法).随着土壤基因组提取技术和基因片段扩增(PCR)技术的发展,大量的现代分子生物学技术不断地涌现并极大地推动了土壤微生物群落多样性的研究进程.这些技术主要包括:G+C％含量、DNA复性动力学、核酸杂交法(FISH和DNA芯片技术)、土壤宏基因组学以及DNA指纹图谱技术等.综述了这些技术的基本原理、比较了各种技术的优缺点并且介绍了他们在土壤微生物群落多样性研究中的应用,展望了这些技术的发展方向.     

Purification and primary structure of low molecular mass peptides from scorpion (Buthus sindicus) venom

The primary structures of four low molecular mass peptides (Bs 6, 8, 10 and 14) from scorpion Buthus sindicus were elucidated via combination of Edman degradation and matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Bs 8 and 14 are cysteine-rich, thermostable peptides composed of 35–36 residues with molecular weights of 3.7 and 3.4 kDa, respectively. These peptides show close sequence homologies (55–78%) with other scorpion chlorotoxin-like short-chain neurotoxins (SCNs) containing four intramolecular disulfide bridges. Despite the sequence variation between these two peptides (37% heterogeneity) their general structural organization is very similar as shown by their clearly related circular dichroism spectra. Furthermore, Bs6 is a minor component, composed of 38 residues (4.1 kDa) containing six half-cystine residues and having close sequence identities (40–80%) with charybdotoxin-like SCNs containing three disulfide bridges. The non-cysteinic, bacic and thermolabile Bs10 is composed of 34 amino acid residues (3.7 kDa), and belongs to a new class of peptides, with no sequence resemblance to any other so far reported sequence isolated from scorpions. Surprisingly, Bs10 shows some limited sequence analogy with oocyte zinc finger proteins. Results of these studies are discussed with respect to their structural similarities within the scorpion LCNs, SCNs and other biologically active peptides.     

Eight polymorphic microsatellite markers developed in the Chinese scorpion, Mesobuthus martensii (Scorpiones: Buthidae)

Eight polymorphic di- and trinucleotide microsatellite loci were developed in the Chinese scorpion, Mesobuthus martensii. The expected heterozygosity at these loci ranges from 0.019 to 0.860, with the observed allele numbers varying from two to 25. Overall, there were no deviations from Hardy-Weinberg equilibrium and no observed linkage disequilibrium after Bonferroni correction. Cross-species amplification of these loci in Mesobuthus eupeus revealed that five loci can amplify successfully in this species. The polymorphic microsatellite DNA markers reported here should provide helpful means to address questions concerning phylogeographical patterns and evolutionary history of M. martensii and closely related species.     

基于16S rDNA基因序列的泽兰实蝇幼虫肠道细菌多样性分析

【目的】探究泽兰实蝇 Procecidochares utilis 幼虫肠道细菌的多样性。【方法】利用Illumina HiSeq技术对泽兰实蝇幼虫肠道细菌的16S rDNA-V6变异区序列进行测序,应用USEARCH和QIIME等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）数量,分析物种的丰度和Alpha多样性。【结果】共获得1 593 506 对reads,拼接为1 579 372条tags,经过滤后得到的1 572 860条tags聚类为1 341个OTU。总共注释到13个门,4个纲,6个目,7个科,10个属和4个种。其中变形菌门(Proteobacteria)的细菌为优势菌,占99%;在属分类阶元上,沃尔巴克氏体属 Wolbachia 占45%,是优势属。【结论】泽兰实蝇幼虫肠道细菌多样性丰富。相关的种类和丰度信息为后期研究揭示肠道细菌介导泽兰实蝇寄主植物专化性奠定了基础。     

汾酒酿造车间和车间外环境中酵母菌多样性研究

为解析汾酒厂区酵母菌资源的多样性,采用分离培养方法,从汾酒酿造车间和车间外环境中的微生物中分离纯化到300株酵母菌,经26S rDNA序列比对分析,检测到酵母菌包括6科15属21种。系统发育树结果表明,汾酒酿造车间和车间外环境中的酵母菌包括担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）两个分支。尽管汾酒酿造车间和车间外环境中各有特异的酵母菌,但是两者都存在与白酒酿造相关的酵母菌如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）等。汾酒环境中含有丰富的酵母菌资源,可能是大曲和酒醅发酵过程中酵母菌的主要来源。这些都为进一步研究指明了方向。     

基于16S rDNA序列的柑桔木虱体内共生菌多样性研究

昆虫消化道内是一个复杂的微生态系统,有大量的微生物存在.这些微生物对寄主发育、营养吸收和防御方面都起着重要的作用.本文利用基于16S rRNA基因的PCR-RFLP指纹图谱法和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)的方法对柑桔黄龙病虫-媒柑桔木虱Di...     

Microbial diversity and function in Antarctic freshwater ecosystems

Freshwater lakes occur through much of Antarctica and are characterized by short food chains dominated by microbes. Comparatively few studies have been made of continental freshwater lakes until recently, with the main emphasis being on the less extreme maritime Antarctic lakes. The wide range of trophic status seen at the northern extremes of the maritime Antarctic reduces markedly further south, but a wide range of micro-organisms occur throughout the latitudinal range. Information on seasonal and spatial patterns of microbial activity for freshwater lakes demonstrate rapid changes in community composition at certain times of year despite constant low temperatures. Benthic communities of cyanobacteria and bacteria are a feature of most lakes and are involved in a wide range of geochemical cycling. There is a need for more detailed taxonomic information on most groups and considerable potential for molecular studies.     

生物浸矿反应器中的微生物种群结构及其中可培养微生物的特征

【目的】本文旨在了解生物浸矿反应器中的微生物种群结构及其中可培养微生物的特征。【方法】通过构建微生物冶金反应器中矿浆原样的16S rRNA基因文库,测定16S rRNA基因序列,分析矿浆中种群结构。同时在不同培养条件下,对样品进行富集培养,分离获得纯菌株;并对各个菌株的16S rRNA基因序列,生理生化特征及对不同矿物的氧化能力进行了分析。【结果】研究中所选生物浸矿反应器中主要的微生物物种有细菌:Leptospirillum sp.,Sulfobacillus sp.,Acidithiobacillus sp.,Spingomonas sp.及古菌Sulfolobus sp.,Ferroplasma sp.等菌属。同时分离出5株纯菌株,这些菌分别与Acidithiobacillus thiooxidans,Acidithiobacillus caldus,Acidithiobacillus ferrooxidans,Leptospirillum ferriphilum,Sulfobacillus thermosul fidooxidans相似。分离获得的菌株具有氧化硫或二价铁和不同硫化矿的能力。【结论】生物浸矿反应器是个微生物种类相对简单的生境,利用非培养和培养技术全面地了解生物浸矿体系中的微生物群落及其生理、浸矿特性,有利于洞察生物浸矿过程中微生物种群结构,强化控制种群组成及浸矿活性,从而提高生物湿法冶金的效率。