人胸腺肽β4基因的克隆表达及活性检测

采用化学与酶促合成技术 ,将胸腺肽 β4基因拆分为两个末端互补的片段进行化学合成 ,经变性、退火以及T4DNA聚合酶延伸过程 ,获得完整编码的基因片段。通过一平一粘末端连接 ,将胸腺肽 β4基因片段克隆入pLDH4 (一种大肠杆菌温度诱导表达载体 )的EcoRV和HindIII位点之间。经克隆筛选和DNA序列测定 ,获得目的基因表达工程菌 ,且表达量占细菌总蛋白质的 30 %。利用盐析和多种层析技术联合纯化该表达多肽 ,纯度达95 % ;活性测定表明纯化的人胸腺肽 β4能够促进淋巴细胞的增殖和分化     

限制性酶切片段的TA法直接克隆与测序

报道了一种粘性末端的限制性酶切片段的直接克隆和测序的方法。对限制性酶切片段的粘性末端先用T4洲A聚合酶处理,变为平末端,然后用Taq^TM DNA聚合酶在其3′末端加上A腺苷,即可利用T／A克隆载体进行直接克隆测序。利用这种简单而快速的方法,对2个RFLP探针Psr680的限制性酶切片段(1．65kb和0．65kb)进行了测序,表明这种方法可以替代利用相应载体进行相应酶切等处理的粘性末端连接克隆测序的方法。     

提高PCR产物及其克隆效率的几点方法与经验

本文介绍了提高ＰＣＲ产物及其克隆效率的方法与经验：如,引物的设计、目的片段的回收、连接体系、利用引物上所设计的酶切位点克隆、通过平末端克隆,以及加快实验进程的技巧、出现问题如何设计查找原因等。     

一种高效通用的平端亚克隆方法

一种高效通用的平端亚克隆方法毛春生，金宁一，顾万钧（解放军农牧大学研究所病毒室，长春１３００６２）关键词平端亚克隆亚克隆是分子生物学和基因工程研究中常用技术之一。在理论上，任何一对平末端ＤＮＡ片段都可经Ｔ４连接酶催化连接。这给不同ＤＮＡ分子之间的连接...     

禽腺病毒江苏株（JS）复制非必需片段的确定

利用PCR方法从一株Ⅰ群禽腺病毒的分离物(FAVI-JS)中扩增出其基因组的两个末端L片段和r片段、ITR片段,并分别克隆进pGEM-T easy载体,然后将L片段、r片段和ITR片段同时克隆进pHC粘粒载体中,获得质粒pHC-FAVI-r-ITR-L,再在该克隆片段中插入增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因,获得转移质粒载体pFAVI-eGFP.将pFAVI-eGFP转染已被该野生型Ⅰ群禽腺病毒分离物感染了的鸡胚肾细胞进行同源重组,通过无限稀释法筛选重组病毒,结果获得了表达增强型绿色荧光蛋白的重组Ⅰ群禽腺病毒rFAVI-eGFP,证明位于基因组右末端r片段和ITR片段之间的位点为病毒复制非必需区,为禽腺病毒的重组基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

平末端DNA随机连接构建重组质粒

目的:拼接DNA片段并克隆。方法:用T4DNA连接酶将DNA片段以平末端随机连接,随后用限制性内切酶切割,琼脂糖电泳分离酶切产物,挑选特定片段纯化回收,与线性化的载体质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞。结果:通过以上步骤,成功拼接了不同DNA片段,构建了含有目的拼接片段的重组质粒。结论:该方法简便、易行、可靠,可作为拼接、克隆DNA的备选方案,在分子生物学研究和基因工程中应用。     

一种通用高效的复杂载体构建的新方法

文章报道了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上随机设计的接头,利用PCR克隆目的片段,再用T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的粘性末端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建为例,应用上述方法构建只需做两次连接、转化,且其重组、转化效率高。数10次实验证明：这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法,该法至今尚未见报道。      

应用T/A策略克隆乙肝病毒pC/C及C基因

以克隆乙型肝炎病毒pC/C及C基因为例,报道了在DNA重组中,当目的基因与载体末端不匹配时可采取的一新方法.用内切酶切取的基因片段为平端时,可在含dATP的反应体系中,用Taq酶的末端转移酶活性在其3′末端加上单个碱基(dA)的突出尾;基因片段为3′凹端时,可在含4种dNTP的体系中,利用Taq酶的聚合酶活性先将其末端补平,再经末端转移酶活性在其3′末端加dA尾;末端经此修饰的基因片段可亚克隆至T载体中,再克隆于其他表达载体中.     

DNA片段的高效克隆

用Taq酶进行PCR扩增时,其PCR产物的3末端有一个附加的A碱基。因此,目前在克隆PCR产物时一般使用T－VCctor。但T—Vector的价格比较昂贵,而使用本试剂盒也可在短时间内使PCR产物与平滑末端载体进行高效连接。PCR产物与平滑末端的载体连接时,有必要除去3廉端的附加碱基,并使其5末端磷酸化。使用TaKaRaBKLKit（BllllltillgKillstiollLigstiollKit）可使这一连串的反应在短时间内完成。PCR产物的末端平滑化与磷酸化反应在一个反应体系内同时进行,一次反应后便可得到能够用于连接的DNA片段。用于连接反应的PCR产物无需进…     

基于XcmⅠ的T载体及其在合成生物学中的应用

为了节约成本和提高实验效率,以商用p MD18-T载体为基础,构建获得了p FL-XS-T载体,其具有符合Biobrick标准的串联XbaⅠ-XcmⅠ-XcmⅠ-SpeⅠ克隆序列,通过对XcmⅠ的酶切处理即可以通过TA克隆方便地克隆PCR片段。克隆验证实验结果表明,经XcmⅠ处理的该载体可以与PCR片段进行TA连接,连接效率及阳性率均可以满足实验室要求并且可以得到Biobrick标准质粒。此外,该载体不仅可以与其余Biobrick标准元件进行串联,还可以作为功能DNA元件的筛选载体。     

两种pUC18高效T载体的构建

T载体是用于直接克隆PCR产物的线性载体.在此之前,克隆PCR片段时一般先用Klenow片段酶或T4DNA聚合酶削平PCR产物两端,克隆过程中又大都不能使用碱性磷酸酶为载体片段脱磷,因为绝大多数PCR引物5’端未磷酸化,T载体的诞生使分子生物学工作者摆脱了这一窘境,而且,T载体的3’端突出的T碱基与PCR产物3’端由于Taq酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的A碱基[1]互补,使载体与PCR产物的连接效率大大提高.由于具有上述优点,T载体从一产生就引起人们极大的兴趣,很多公司也相继推出了各自的T载体系统,并运用该技术改造了很多传统载体.本…     

一种平末端连接的有效方法

转化效率与质粒大小成反比,而当质粒大于１５ｋｂ时,转化效率将成为限制因素,此时提高连接效率极为必要,特别是对于具有普遍性而效率又低的平末端连接。我们在连接反应体系中,加入相应的产生平末端质粒载体的限制性内切酶Ｈｐａ Ｉ、或ＥｃｏＲ Ｖ,与不加Ｈｐａ Ｉ,或ＥｃｏＲ Ｖ的连接反应相对照,连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９后,产生的转化子比率分别为１９．９％和１０．３％（ｐＦｐ７）,３２．６％和９．７％（     

T-载体的构建

T载体是近年发展起来的‘种用于直接克隆P（：R产物的新的载体，其分f末端有一个悬挂的脱氧胸耷（dT），刚好时与PCR产物末端的dA配对，这样对将PCR产物以粘端连接的方式直接克隆到我体肝去。这种方式不仅克服了常规克隆方法的缺点，而月操作简便、方法快捷、连接效率高，应用Bfi广泛。本文采用近年建立的一种新方法构建T载体。首先采用人丁方法合成‘段双链富核控酸接头（Linker），接头的序列为：XcmlBgllXcrnl5‘一MTlAfXiAJMGAGAThfltX：AfXiGTAIAtXX7TGGGGG－3”下一GGGGG～！A3XIGIALX3HT？Af；＝nuuiutx【T…     

基于抗性恢复的高效克隆超短片段重组质粒的构建

分子克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的分子克隆中,主要通过限制性内切酶先分别消化目的 DNA片段及载体,再纯化回收,然后用DNA连接酶将二者连接。而对一些超短基因片段(300 bp),通过酶切及切胶纯化后,回收率极低,导致插入表达载体比较困难。文中介绍了一种新的利用质粒抗性恢复进行克隆的方法,大大提高了克隆效率,为短基因片段的分子克隆提供了一种高效的方法。     

耐热DNA连接酶介导的TLCR技术在简化DNA重组实验中的应用

传统的DNA重组方法Type Ⅱ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction, TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用耐热型DNA连接酶的特性,在热循环反应中配合针对目的片段末端序列设计的单链寡核苷酸连接模板--Helper,实现目的片段的特异性连接和产物数量的指数性增长。两个质粒构建实验被用于验证TLCR技术的可行性和应用效果。首先利用TLCR技术从一个未经纯化的含有7种不同大小片段的混杂体系中特异性地将一段1.5 kb的片段捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验准确率达到80%,验证TLCR技术在复杂混合体系中特异性连接DNA片段的可行性和准确性。在另一个质粒构建实验中,TLCR技术从λ噬菌体基因组Hind消化物中将两段总长达27 kb的片段按顺序捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验同样达到了80%的准确率。结果表明,TLCR技术能够简化DNA重组实验的操作,并且适用于多片段和大片段的连接,可以为生物学研究提供便利。     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

融合有酸性片段的抗菌肽串连重复基因的构建

为提高抗菌肽的表达,设计在抗菌肽基因的N端融合一段编码酸性肽的片段以及减轻表达产物对宿主的毒性,通过含有酶切位点的接头将该融合肽基因以同向串连的方式连接成多拷贝基因,克隆至pUC19载体。为此,分段设计合成了编码天蚕素A-蜂毒素杂合肽和酸性肽的DNA片段。首先将其连接成融合肽全基因,然后分别与含相同粘性末端的前后接头连接。通过控制基因和接头加入的量及次序,可得到两侧有EcoRI和SalI酶切位点的同向串连的多拷贝基因。选取合适拷贝数的基因,将其克隆至pUC19载体,PCR扩增和DNA测序证明多拷贝基因构建成功且基因方向相同。结果表明,该方法能简捷高效地获得所需的多拷贝基因,为提高表达产物的量打下基因。     

人脑髓鞘碱性蛋白cDNA体外扩增、克隆和鉴定

采用聚合酶链反应(PCR)从人脑cDNA文库中扩增出600bp的髓鞘碱性蛋白(MBP)cDNA片段,与载体pGEM-3Zf(+)平端连接.重组质粒DNA转化宿主菌JM109,在含X-gal和IPTG的平板上直接筛选阳性克隆.限制性内切酶分析和成套引物扩增鉴定证明,该克隆含有7个外显子的21.5kD人脑MBP全长编码序列.     

绿色木霉纤维素酶CBHII基因的分子克隆

本文以噬菌体lambda EMBL3 DNA为载体,通过克隆绿色木酶(Trichoderma viride)高分子量基因组DNA的部分酶解片段,并将重组分子进行体外包装后侵染Escherichia.coli K802,由此构建了绿色木霉基因文库。以李氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶CBHII基因的末端片段为探针,用轮迥噬菌斑原位杂交从文库中筛选出CBHII基因的阳性克隆5个,随机取其中3个克隆用上述探针作斑点杂交,结果进一步证明克隆了全长或近全长的绿色木霉CBHII基因,用李氏木霉CBHI基因的末端片段探针作斑点杂交,结果提示CBHI与CBHII基因的末端序列之间无同源性存在。从斑点杂交的阳性克隆中提取DNA,酶切鉴定插入片段的长度,并克隆于质粒pUC19,Southern杂交结果证明获得了含绿色木霉CBHII基因的重组质粒pCBHII-14。     

中国人HIV辅助受体CXCR4基因的克隆及序列测定

为了获得HIV辅助受体CXCR4基因,进一步探索艾滋病(AIDS)的诊断、防治方法,采用逆转录巢式聚合酶链式反应(RT-nPCR)从中国人外周血淋巴细胞中克隆了CXCR4 cDNA基因,得到了预期的1 100bp左右的片段.将PCR产物与T载体连接,并进行了酶切反应鉴定,获得与T载体正向连接的克隆.测序结果表明克隆的片段含有一个开放性阅读框架,编码352个氨基酸残基.搜索GenBank,目标片段与M99293、XM051223、XM051224、XM051225有很高的同源性,比较结果显示克隆的片段包括完整的编码序列,含两个碱基的差异.