小鼠骨髓细胞中p16和Ralb基因启动区CpG岛的甲基化位点分析

抑癌基因p16和白血病致癌因子Ralb与白血病的发生密切相关,其启动子区CpG岛的甲基化对基因表达具有重要作用.本文旨在分析p16、Ralb基因启动子区CpG岛甲基化位点信息,并比较这两个基因在小鼠骨髓细胞和原代培养的骨髓细胞中甲基化状态的差异.运用"MethPrimer"软件预测p16、Ralb基因启动子区的CpG岛,设计甲基化特异性引物.利用重亚硫酸盐测序法(BSP)检测甲基化位点信息.结果显示,p16有1个CpG岛,岛上21个CpG位点全部未发生甲基化;Ralb有2个CpG岛,CpG岛1上的5个CpG位点全部呈甲基化状态,而CpG岛2上的17个CpG位点全部呈非甲基化状态,且小鼠骨髓细胞和体外原代培养的骨髓细胞中两基因的甲基化状态一致.表明p16、Ralb基因甲基化状态未受外界培养条件的影响而改变,提示在与两基因甲基化相关的研究中体外试验可替代体内试验.     

奶牛产奶性状与乳房炎相关基因CpG含量及分布特征的比较分析

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,基因启动子区及第一外显子区的CpG甲基化通常抑制该基因的表达,而去甲基化则促进基因表达。已有的研究发现荷斯坦牛的乳房炎指标SCC(Somatic cell count)与产奶量呈较强负相关。文章分析并比较了这两类性状的相关基因的启动子区、第一外显子、下游2 000 bp序列中CpG含量及分布特征。结果表明,乳房炎相关基因的启动子、第一外显子中CpG含量显著低于产奶性状相关基因,而两类性状基因下游2 000 bp序列中CpG含量无显著性差异。另外,文中提出了两个量化基因序列中CpG特征的指标,一个是CpG平均距离,用来衡量序列中的CpG分布;另一个是条件概率p(G|C),用以量化序列中二核苷酸CpG随碱基C出现的可能性,并对两类基因的启动子和第一外显子区域的这两个指标做了统计检验。研究结果对产奶性状与乳房炎相关基因的DNA甲基化调控研究奠定了基础。     

人类胚胎干细胞分化前后CDCA8基因启动子区甲基化状态的实验研究

目的：分析在人类胚胎干细胞分化过程中,CDCA8基因启动子区甲基化的状态.方法：生物信息学预测人类CDCA8基因上游2 kb区域的CpG岛.抽提未分化和自然分化的人类胚胎干细胞gDNA,应用重亚硫酸盐修饰和DNA序列分析方法检测CDCA8基因启动子区CpG岛甲基化情况.结果：未分化和自然分化的人类胚胎干细胞中,被检测的CDCA8基因启动子区CpC岛均未发现明显的甲基化修饰.结论：在人类胚胎干细胞分化前后,CDCA8基因启动子关键区域的甲基化状态未发生明显改变.     

抗癌基因──p53和Rb基因甲基化的研究进展

介绍p53和Rb基因甲基比研究的最新进展.CpG序列是DNA甲基化和基因突变的频发位点.p53和Rb基因的CpG序列易发生甲基化.其高度甲基化可能与基因功能失活有关,从而丧失抑制细胞增殖的功能,可能为肿瘤等发生的重要原因之一.     

DNA 甲基化及其对肿瘤的作用

DNA甲基化是一种重要的表遗传修饰,在肿瘤细胞中表现为基因组整体水平的低甲基化和一些特定区域的高甲基化,发生低甲基化的序列主要是一些高度和中度重复序列,而发生高甲基化序列通常是跨越管家基因和肿瘤抑制基因启动子的CpG岛,它们在肿瘤的发生发展中起重要的作用,本文就这些序列的异常甲基化和其对肿瘤作用一些进展和观点作一介绍。     

DNA甲基化与基因表达调节

DNA异常甲基化是一种表观遗传改变,常发生在启动子区的CpG岛。某些基因甲基化与基因表达密切相关,在生命过程中扮演着重要功能。一方面,DNA甲基化与高等动物的生长发育密切相关,另一方面,DNA甲基化和其他生命过程也有重要的联系。如X染色体失活、基因组印记、发育调控及细胞分化和肿瘤发生发展中起重要作用。     

玉米MuDR转座子DNA甲基化的MSP检测

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,广泛存在于高等动植物中,并在维持基因组稳定性、调节基因表达等方面起着重要作用,因此建立快速有效地DNA甲基化检测技术至关重要.本文以两种不同MuDR活性的玉米转座子材料为研究对象, 探讨了甲基化特异性PCR(MSP)在检测DNA甲基化的有效性.结果表明: MSP技术可快速有效地检测MuDR转座子的末端反向重复(TIRs)序列内的CpG岛DNA甲基化的变化,灵敏度高,特异性强,可作为植物已知基因DNA甲基化检测的一种新方法.同时利用MSP研究发现,玉米MuDR转座子的活性随其TIRs序列内的CpG岛DNA甲基化的变化而改变, DNA甲基化是调控玉米MuDR转座活性的重要分子机制之一.     

结直肠癌中DNA甲基化研究进展

CpG岛是人类基因组中富含CpG二核苷酸的DNA序列,主要位于基因启动子区,大小约为100-1000bp,与约60％编码基因相关。DNA中CpG岛甲基化可导致抑癌基因的表观遗传学转录失活,直接参与肿瘤的发生机制。近年来,甲基化已成为表观遗传学研究的焦点。我们简要综述了DNA甲基化在结直肠癌中的研究进展。     

DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的：探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2＇-脱氧胞嘧啶（5-Aza-CdR）处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果：DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论：抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

DLC-1 基因在MCF-7 人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的:探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果:DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论:抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。     

宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。     

基因组差异甲基化片段筛选技术

分离和鉴定细胞之间的差异甲基化片段,不仅有助于了解基因的功能、分离疾病相关基因,而且可以发现与细胞分化或病变相关的甲基化标记。目前筛选差异甲基化DNA片段的方法主要有：甲基化敏感的限制性界标基因组扫描、甲基化敏感的代表性差异分析、甲基化敏感的限制性指纹技术、甲基化CpG岛扩增．代表性差异分析、微阵列技术等。其中微阵列法又先后建立有CpG岛微阵列、寡核苷酸微阵列和表达CpG岛序列标签微阵列。这些方法各有特点和适用范围,应根据具体研究目的和工作条件进行恰当的选择。     

牛组织中MBD1基因表达及其DNA甲基化调节

DNA甲基化是主要的表观遗传调节方式,在转录水平调节基因的表达,甲基化CpG结合蛋白MBD1能够结合甲基化及非甲基化的DNA,通过抑制域抑制基因的转录,在DNA甲基化和转录抑制之间起重要作用,但DNA甲基化对MBD1自身的调节作用还不清楚.本研究首先利用RT-PCR检测成年牛心脏、肾脏、肝脏、睾丸及卵巢5种组织中MBD1基因mRNA的表达;并根据牛MBD1调节区序列,针对其中的12个CpG位点设计引物,利用甲基化PCR测序分析方法,分析该调节区的DNA甲基化状态在牛5种组织中的变化.结果表明,在牛的5种组织中,MBD1基因在心脏和肾脏的表达量低于肝脏、睾丸及卵巢,且差异显著(P＜0.05);DNA甲基化检测显示,心脏和肾脏MBD1调节区的甲基化比率较肝脏、睾丸及卵巢甲基化低,说明调控区DNA甲基化与MBD1基因的组织特异性表达相关.     

甲基化特异性PCR检测FMR1 和XIST基因甲基化实验方法的建立

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因（Fragile X mental retardation, FMR1）和X染色体失活基因（X chromosome inactivation,XIST）甲基化的方法,用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰。以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对：1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因（CGG）n重复序列区、FMR1 和XIST 基因的启动子区。PCR产物进一步克隆、测序。以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板,进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物。测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变。成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法。     

hMLH1基因启动子CpG岛甲基化致MSI与肿瘤的关系

通过人类错配修复基因( hMLHl)启动子CpG岛甲基化与微卫星不稳定性(MSI)的分析,探讨癌症发病的机制.错配修复基因hMLH1启动子CpG岛甲基化是hMLH1基因失活的重要机制,而hMLH1的表达失活则可导致MSI的产生,促进癌症的发生.根据一系列研究得出结论,在肿瘤组织中hMLH1基因启动子CpG岛甲基化和微卫星不稳定(MSI)有显著相关性,并在癌症早期发生、发展过程中起重要作用.因此临床检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化及微卫星不稳定可能成为癌症鉴别诊断、评价预后、指导化疗的分子标志物之一.     

HDAC4基因甲基化对hMSCs向汗腺样细胞诱导转分化的影响

目的：探讨在诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）转分化为汗腺样细胞过程中,组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）甲基化的改变及其对诱导转分化过程的影响。方法：选取人骨髓间充质干细胞系体外培养、扩增后,取第三代hMSCs与热休克处理的汗腺细胞进行Transwell+诱导因子的共培养。收集诱导后实验组的汗腺样细胞和同期对照组的hMSCs,采用甲基化特异性PCR（MSP）和飞行质谱（Mass Array）法检测HDAC4基因启动子区CpG岛甲基化状态的变化,随后采用甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-CdR,10 μmol/L）处理实验组hMSCs,对照组为同期培养的hMSCs,RT-PCR测定两组细胞HDAC4基因和癌胚抗原（CEA）基因的mRNA表达量。结果：诱导前hMSCs中HDAC4基因整体甲基化水平较高,探针cg2463009处CpG位点甲基化程度为0.901,诱导转分化后汗腺样细胞中HDAC4基因整体甲基化水平下降37%,甲基化程度为0.531;探针cg14823429处CpG位点甲基化程度由诱导前的0.687下降到0.386。5-aza-CdR处理48 h后,实验组HDAC4基因mRNA表达水平上调,与诱导转分化相关的CEA mRNA同期表达量也增强,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：HDAC4基因的甲基化参与了hMSCs转分化为汗腺样细胞过程的调控。     

乳腺癌相关基因的甲基化

肿瘤组织中常伴随基因组整体甲基化水平降低和(或)某些基因CpG岛甲基化水平异常升高,这两种变化在肿瘤发生和发展中都扮演着重要的角色。近年来诸多研究报道了CpG岛高甲基化可导致乳腺癌相关的一系列关键基因的表达缺失。由于表观遗传变化存在潜在可逆性,因此,通过检测患者特定基因甲基化状态早期诊断乳腺癌,以及运用甲基化抑制剂来治疗乳腺癌,已成为国内外研究的热点和新思路。     

一种快速高效的全基因组甲基化CpG岛富集方法的建立

高甲基化的CpG岛所致基因表观遗传学转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重要内容。现在已有很多检测CpG岛甲基化的方法,但由于各自的局限,还没有建立一种能快速在全基因组水平上进行甲基化CpG岛的富集方法。本研究利用甲基化结合蛋白MBD2b具有特异性结合甲基化DNA的特性, 建立了一种基于DNA免疫共沉淀技术的全基因组甲基化CpG岛的富集方法。在大肠杆菌中表达重组的GST-MBD2b蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B对重组蛋白进行纯化,制备成亲和层析柱,利用在不同的盐离子强度下甲基化DNA和非甲基化DNA的结合能力不同,对甲基化DNA进行富集。用甲基化酶SssI处理过的DNA片段与非甲基化DNA片段进行富集效率的检测,发现0.5M KCl的浓度是甲基化DNA片段和非甲基化DNA片段得以分开的临界条件。样品的富集效率用Real Time PCR进行检测。结果表明,这种方法能够实现对全基因组甲基化DNA的有效富集且最高的富集倍数可达到100多倍。富集到的甲基化DNA可以进行后续的定量PCR, DNA测序和全基因组芯片的分析等工作,为大规模分析全基因组CpG 岛甲基化的改变奠定了基础。     

贵州矮马IGF-I启动子-529 CpG甲基化及个别核苷酸变异与贵州矮马矮小表型有关

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors,IGFs）和生长（激）素（growth hormone,GH）是动物机体主要的促生长因子,它们的表达水平直接决定成熟个体的高度。贵州矮马的体高明显低于伊犁马等大型马,但其原因尚不清楚。本研究从贵州矮马基因组DNA中克隆了GH和IGF-I基因5′-侧翼序列,分别为239 bp和817 bp,包括部分启动子结构;进而采用生物信息学、比较基因组学方法对比分析了贵州矮马与伊犁马两个基因5′-侧翼序列/启动子的转录因子结合位点及潜在甲基化位点（CpG岛）分布。亚硫酸氢盐PCR测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）显示,两个马群的GH基因5′-侧翼区域（239 bp）内的6个CpG位点均发生了甲基化,甲基化频率无明显差异。然而,在IGF-I基因5′-侧翼区的148 bp片段内含有4个CpG位点中,贵州矮马的-529 bp处CpG位点的甲基化程度明显高于伊犁马（P < 0.01）,且该甲基化位点处于基本启动子邻近3′端;此外,两个马群IGF-I基因5′-侧翼区的-561 bp处检测到T、C碱基改变,导致贵州矮马的顺式调控元件/转录因子结合位点较伊犁马少1个,有可能影响IGF-I基因的转录效率。血清IGF-I浓度测定揭示,贵州矮马血清IGF-I含量极显著低于伊犁马（P< 0.01）。Spearman相关性结果显示,贵州矮马及伊犁马的IGF-Ⅰ基因甲基化频率与血清IGF-I浓度呈中度负相关（r=-0.468）,提示IGF-Ⅰ基因甲基化抑制其编码蛋白质的表达。结果证明,IGF-I启动子高甲基化及某些核苷酸（碱基）序列变异可能是贵州矮马个体矮小的部分原因。