赤羽病病毒核蛋白基因克隆和序列分析

参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAVBHK21细胞培养物巾提取总RNA,对．AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,同收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析。与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94．2％～98．3％,推导的氨荜酸的同源性为97．6％～100％,证实为AKV的N基冈。为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础。     

矛尾鱼Hoxa—11基因克隆及5′端序列分析

Hoxa-11基因调节鱼类鳍和四足动物肢的发育,在脊椎动物进化过程中起着重要的作用,利用人和鼠的Hoxa-11基因保守序列设计了两个兼并引物,通过PCR扩增到了矛尾鱼的Hoxa-11基因,经克隆和DNA序列分析,该片段为2065bp,包括绝大部分外显子Ⅰ,内含子和部分外显子Ⅱ,编码204个氨基酸,其氨基酸序列与人、鼠、鸡、蛙和斑马鱼的同源性分别为66.0%、67.6%、74.4%、72.8%和59.7%。外显子Ⅰ的长度从矛尾鱼到蛙、鸡、鼠和人呈现逐步上升趋势,人比矛尾鱼增长了16%,进一步分析,外显子Ⅰ可分为4个区域;两个高度保守区域,1个中度保守区域和1个可变区域,外显子Ⅰ的长度变化主要是由于可变区域内丙氨酸同聚物以及两侧富含甘氨酸和丝氨酸序列的累积。矛尾鱼只有1个由两个丙氨酸组成的同类物,蛙有1个由5个连续丙氨酸组成的同聚物,而鸡、鼠和人有3个丙氨酸同聚物,其中最大的同聚物由7个连续丙氨酸组成,而且在同聚物两侧出现了富含甘氨酸和丝氨酸序列。这表明可变区域可能与脊椎动物进化和鳍-肢转换过程中新功能的获得有关。同源异型盒所在的外显子Ⅱ区和剪接位点是高度保守的。内含子的长度变化较大,但在其内部也发现了两个高度保守的35bp和16bp的DNA片段,这两个片段在人、鼠、鸡、蛙和矛尾鱼中是完全相同的,这些序列的高度保守性提示其功能上的重要性。     

黄花苜蓿LEA3基因片段克隆与生物信息学分析

根据紫花苜蓿LEA3-1 mRNA(EU665182)的cDNA序列,设计1对特异引物,以经过ABA干旱胁迫处理的黄花苜蓿为材料,提取总RNA.采用RT-PCR方法克隆获得了747 bp的cDNA片段,命名为MfLEA3-1(GenBank登录号:HQ327439).推测该序列编码了248个氨基酸,这些氨基酸主要由10.1％苏氨酸(Thr)、24.6％丙氨酸(Ala)、17.7％赖氨酸(Lys)和12.9％天冬氨酸(Asp)组成,不含有半胱氨酸和色氨酸,这与其他物种LEA蛋白成分非常接近.该氨基酸序列中存在13个11-mer重复序列,根据第3组蛋白分类标准,MfLEA3-1蛋白比较接近于type Ⅰ,但是11-mer重复中残基分布与type Ⅰ有所不同,推测MfLEA3-1蛋白属于新的第3组LEA蛋白类型.黄花苜蓿中成功获得了LEA3基因片段,为最终克隆黄花苜蓿LEA3基因序列全长奠定基础.     

红罗非鱼MyoD基因克隆及序列分析

MyoD基因是MRFs家族中的一员,能调控肌肉细胞活性和增殖,在肌肉形成过程中起正调控作用。采用同源基因克隆和RACE方法获得红罗非鱼Myo D基因的c DNA序列。开放阅读框长903 bp,编码300个氨基酸,其中第1-114个氨基酸为碱性结构(Basic domain),第109-165个氨基酸为螺旋-环-螺旋结构(Helix-Loop-Helix domain),第199-213个氨基酸为周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)结合区域,第233-249为Helix III结构,无信号肽序列。Myo D蛋白的二级结构为螺旋-环-螺旋二聚体。基于Myo D构建的鱼类系统进化树显示红罗非鱼,尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼聚为一支。     

赤羽病病毒核蛋白基因克隆和序列分析

参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAV BHK21细胞培养物中提取总RNA,对AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析.与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94.2%～98.3%,推导的氨基酸的同源性为97.6%～100%,证实为AKV的N基因.为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.     

苹果蠹蛾线粒体DNA COⅠ基因克隆与序列分析

本研究采集新疆阿拉尔地区苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)幼虫,对其线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行了扩增、克隆和测序,并对COⅠ序列进行了分析。结果显示:苹果蠹蛾DNA扩增出的COⅠ基因序列片段长度为709bp,序列中A+T含量极高,占68.7%,而G+C的含量只有31.3%。经基因序列比对,与其它几种食心虫的同源性为85.4%～88.1%,遗传距离为0.130～0.162;采用NJ法构建了卷蛾科系统树,所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。本研究结果为苹果蠹蛾快速鉴定的DNA条形码技术研究提供重要基础。     

斑节对虾溶菌酶基因克隆及序列分析

参考对虾溶菌酶基因和类溶菌酶基因及其他多种生物的溶菌酶基因序列 ,设计并合成引物。运用RT PCR技术 ,从斑节对虾血细胞总RNA中扩增获得特异性片段。所获片段回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明 ,所克隆的斑节对虾溶菌酶基因片段长 6 5 8bp ,包括溶菌酶基因开放阅读框 (ORF)4 77bp和 3′端非编码区的 181bp。 4 77bpORF共编码 15 8个氨基酸 ,包括溶菌酶成熟肽 14 0个氨基酸残基和信号肽 18个氨基酸残基。斑节对虾溶菌酶成熟肽推测分子量为 16 ,32kd ,等电点为 8 78。与南美白对虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列比较 ,同源性分别为 89 5 %和 93 0 % ;与日本对虾类溶菌酶基因的同源性分别为 84 0 %和91 0 %。进一步的序列分析表明 ,斑节对虾溶菌酶氨基酸序列与多种类群生物的c 型溶菌酶氨基酸序列具有较高的同源性 ,并具有与c 型溶菌酶相同的活性位点氨基酸残基Glu51和Asp68,且与活性位点相邻的序列高度保守。斑节对虾溶菌酶氨基酸序列还具有与c 型溶菌酶相同的结构氨基酸——— 8个半胱氨酸残基。因而可认为所克隆的斑节对虾溶菌酶基因属c 型溶菌酶基因。     

禽Ⅰ型副粘病毒f基因克隆及序列分析

用RT-PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽I型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其f基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽I型副粘病毒各毒株同源性为88.1%～94.9%,与疫苗株LaSota和强毒株F48E9的同源性为85.6%.所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112～117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株.鸽I型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMV ZQ98-1株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株.以1 662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒属于基因Ⅶ型,鸽I型副粘病毒属于基因Ⅵ型.     

野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与序列分析

为了挖掘野生稻中的抗病资源,根据已克隆的植物抗病基因核苷酸结合位点序列中的保守结构域设计3对简并引物,从疣粒、药用、高秆、宽叶和斑点野生稻基因组DNA中分离出13条NBS类抗病基因类似物,其中11条具有连续的ORF,具有NBS类R基因的保守基元P-loop、kinas-2、kinas-3a和GLPL。在NCBI上进行同源性搜索发现,其中12条RGAs的核苷酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有66%～94%的同源性,与其他植物已知R基因具有67%～84%的同源性;其对应的氨基酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有43%～93%的同源性,与其他植物已知R基因具有37%～79%的同源性。另外1条的核苷酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有76%的同源性,其氨基酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有74%的同源性。根据序列分析结果设计6对不同基因特异性引物,并利用RT-PCR技术进行表达分析,结果表明,RN1BD5、RN1BD10、RN1GG2和RN1YY6均能表达,说明这些片段可能是功能性抗病基因的部分序列;而RN1KY9和RN1GG5没有表达,可能是假基因。     

金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析

根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分eDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列.序列拼接得到完整的1 248bp的黄酮醇合成酶基因,根据获得的序列,设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸.序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86％、83％和80％,与其它物种的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性.     

血管紧张素转换酶的克隆及序列分析

根据GenBank上公布的小鼠血管紧张素转换酶(ACE)基因序列,经多重比较设计1对特异性引物,从小鼠Balb/c肺部组织中提取总RNA,进行RT-PCR。产物经纯化回收,克隆到pMD-18T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行序列分析。测序结果显示,该片段全长4 023 bp,开放阅读框(ORF)包含3 985 bp,编码1 328个氨基酸,相对分子质量为152.77 kD,等电点6.35。此序列与GenBank已登录的小鼠ACE同源性达99%,差异的5个碱基位于基因的非关键部位,说明小鼠ACE成功克隆。经同源性比较分析,达50%以上相同性的物种有17个,且符合种属之间的进化关系。因此,该序列可于研究物种亲缘关系或遗传距离的理想标记,为下一步研究其在酵母中的表达、生物活性和应用奠定了一定的基础。     

毛尖紫萼藓GpUCH基因克隆及表达分析

从毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中筛选了一条与抗旱相关的泛素羧基末端水解酶基因的EST序列,采用RACE技术从毛尖紫萼藓中克隆出了该基因的cDNA全长序列,命名为白UCH。对该基因的序列特征、进化关系和表达谱进行了分析,为全面研究其功能奠定了基础。该基因cDNA全长951bp,开放阅读框711bp,共编码236个氨基酸。生物信息学分析显示,印UCH基因相对分子质量为25．7kD,等电点为4．67,为不稳定蛋白,属于跨膜蛋白但不存在信号肽。系统进化树分析表明,GpUCH与小立碗藓UCH蛋白一致性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GpUCH基因在复水和干旱的条件下均能表达,但是在不同的条件下表达情况差异显著。表明该基因可能在毛尖紫萼藓干旱过程中发挥一定的作用。     

嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与序列分析

以嗜水气单胞菌BZ和NK分离株的DNA为模板,采用PCR技术,扩增气溶素基因(aerA)的DNA片段,将其克隆到pMDl8-T载体上.通过序列测定,分析结果表明:所克隆的1393 bp片段为aerA部分序列,编码产生464个氨基酸.BZ与NK之间aerA核苷酸同源性为97.6%.氨基酸同源性为98.3%,与其它分离物核苷酸同源性为71.6%～97.5%,氨基酸同源性为68.0%～98.9%.利用邻接法构建了aerA分子树状图,树状图分析表明:气单胞菌属各分离物聚为三支,其中嗜水气单胞菌各菌株之间关系密切,被聚类为同一支.     

嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与序列分析

以嗜水气单胞菌BZ和NK分离株的DNA为模板, 采用PCR技术, 扩增气溶素基因(aerA)的DNA片段, 将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定, 分析结果表明：所克隆的1393 bp片段为aerA部分序列, 编码产生464个氨基酸。BZ与NK之间aerA核苷酸同源性为97.6%, 氨基酸同源性为98.3%, 与其它分离物核苷酸同源性为71.6%~97.5%, 氨基酸同源性为68.0%~98.9%。利用邻接法构建了aerA分子树状图, 树状图分析表明：气单胞菌属各分离物聚为三支, 其中嗜水气单胞菌各菌株之间关系密切, 被聚类为同一支。     

Cloning and Expression Analysis of GpUCH Gene in Grimmia pilifera

A drought resistance gene was cloned from drought cDNA library of Grimmia pilifera, the gene relatived to ubiquitin carboxy terminal hydrolytic enzymes (UCH), named GpUCH. The cDNA fragment of GpUCH was cloned from Grimmia pilifera through rapid amplification of cDNA ends (RACE). To further study the function of GpUCH gene, it was necessary to describe the sequence characteristics, evolutionary relationship and gene expression. The full length cDNA was 951bp with an pen reading frame of 711bp which encoded 237 amino acid with a molecular weight of 257kD, and the isoelectric point is 467. The result of bioinformatics showed that this protein was unstable transmembrane protein and had no signal peptide. The phylogenetic tree showed that GpUCH and Physcomitrella patens UCH protein had a close relationship. QRT PCR analysis showed that the expression of GpUCH gene was induced in both rehydration and dehydration.Under different conditions the expression of GpUCH were obviously varius. The results suggested that GpUCH gene might play an important role in drought stress.     

家蚕BmST2基因的克隆与转录活性检测

通过生物信息学分析和生物学试验获得了家蚕糖转运蛋白基因BmST2(GenBank登录号:GQ871755),基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1398 bp,编码465个氨基酸,预测蛋白序列有典型的Sugar_tr结构域和11个疏水的跨膜结构域,与家蚕BmST1蛋白相似性和一致性分别达79%和64%,与登录号为EAT47626、EDS35465、EAA11457和EFA05337的同源蛋白相似性在50%以上。RT-PCR检测基因在5龄第3天家蚕幼虫的9种组织中转录活性,结果显示,BmST2基因除在脂肪体没有表达外,其他组织均有表达。最后成功构建了基因的酵母穿梭表达质粒pG-BKT7-BmST2。     

甜菜NADH-NR基因的克隆和序列分析

利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜品种甜研7号(Ty7)中获得氯素诱导NADH-NR基因片段,通过RACE技术克隆NADH-NR基因全长序列.该基因ORF长度2 718 bp,编码905个氨基酸,包括147 bp的5'UTR和382 bp的3' UTR,GenBank上的注册号为EU163265,基因编码蛋白的等电点为6.12,推测分子量大小为102 kD,C端(778-891 aa)有一个跨膜区域.基因编码多肽含有3个氧化还原功能区:钼辅因子功能区(eukary NR Moco,93 - 478aa),Fe-血红素结合区(Cytb5,535 -608 aa),FAD结合区(FAD binding 6,653 -760 aa).在甜研7号NR下游的氨基酸残基中含有NADH-NR特有的CGPPP-M基序,说明该蛋白以NADH为电子供体.通过比对,甜研7号的NADH-NR基因与菠菜NADH-NR基因同源性最高,为86.18％.经Southem杂变检验,甜研7号中NADH-NR基因以低拷贝数存在.经基因组克隆分析,甜研7号NADH-NR含有3个内含子,4个外显子.