DNA顺序有序测定中特定亚克隆的 简便检出

在按非随机法测定策略由Dnase I处理获得大量亚克隆后,随机从中选出一些亚克隆测定其DNA顺序,就可以迅速获得几组彼此不相联的亚克隆组,以这些亚克隆组首尾的克隆作电泳对照,与混合克隆同时电泳,就能方便地检出填平克隆组间空缺的特定亚克隆。用此方法,我们迅速完成了对含有psr基因的4064bp DNA片段的DNA顺序测定。     

高温反向顺序测定

单链克隆DNA的反向测序是一个简单和快速的方法,这个方法可利用原来的DNA再进行反向顺序测定,从而达到校正和积累DNA数据的作用。由于反向测序的本质是双链测序,所得到的DNA顺序的图谱背景较深,伴有杂带,或在x光显影上是不清晰的。本文报道利用我们实验室所开发的热稳定性的Bst聚台酶系统,进行反向测序克服了这些缺点,获得的图谱可以和单链DNA模板测序的图谱相媲美。我们以nod D 487-mp 8 ss-DNA为模板进行反向测序,证明Bst聚合酶在65℃反应能得到满意的结果。     

懒猴高重复顺序DNA的核苷酸顺序分析及其与类α-DNA顺序的比较

为确知懒猴高重复顺序与灵长类类α顺序间的相互关系,我们将懒猴DNA经EcoRI酶切所得到的高重复顺序DNA的最小片段重组到质粒pUC~(12)上,经转化、筛选、鉴定得到含有懒猴高重复顺序片段的克隆,命名为pLS(EcoR Ⅰ)-1,测定其全部核苷酸顺序为641bp,发现该顺序有与类α顺序的相似性,但变异性较大,我们对此进行了讨论。     

大鼠高重复顺序DNA的核苷酸顺序分析及其与灵长类类α-DNA顺序的比较

 啮齿目动物高重复顺序DNA的结构特征,虽已有人进行过分析,并提出大鼠DNA中有酶切位点分布独特的高重复顺序,也有人认为在Sprague-Dawlay大鼠中有类似于α-DNA大小的高重复顺序,并命名为α型(α-type),是否大鼠中也含有类α顺序,并没有人讨论过。我们对Wistar大鼠高重复顺序DNA进行了分离、纯化、分子克隆及核苷酸序列分析,测定了全序列为370bp,它也是具有酶切点分布独特的高重复顺序,但与前者存在着18％的差异性。我们对此顺序与灵长类类α-DNA进行了比较分析,发现二者在几方面都不存在相似之处,如此序列G-C含量占全部碱基组成的37.3％,而类α顺序的G-C含量约在40％以上,一些酶切位点也与类α-DNA完全不相同,另外在此序列的相应位置上也不具有灵长类类α-DNA的三个“冷点区”等等,由此得出大鼠这一高重复顺序并非类α顺序,而类α顺序只是灵长类动物所特有的。     

不断发展的DNA序列测定技术

DNA的核苷酸顺序是分辨率最高的物理图谱,它提供了有关遗传设置的重要信息,因而,测定DNA的核苷酸排列顺序是我们认识基因结构、调节和表达的基础,也是进一步进行DNA大分子操作的前提条件。从1965年Holly等完成了酵母丙氨酸75个核苷酸的测序工作以来,核酸序列分析特别是DNA测序就引起了人们极大兴趣。在短短的二十几年内,DNA测序技术在方法策略、精度和效率等方面都取得了惊人的进展。一、DNA序列测定的基本策略酶法和化学法都是70年代提出的二种DNA测序的方法,到目前为止,它们仍     

重复DNA顺序pRRD9在稻属中的拷贝数测定

本文应用狭缝印渍杂交方法,把水稻基因组总DNA和含水稻中度重复顺序片段的质粒(pRRD9)DNA分别转移到尼龙膜上形成狭缝印渍、然后用~(32)P标记的 pRRD9插入片段进行杂交、根据各狭缝印渍的放射性强度,测定水稻(Oryza)一些栽培种和野生种基因组中重复DNA顺序的拷贝数,并就拷贝数与水稻进化关系及基因组型的联系进行讨论.     

重复DNA顺序pRRD9在稻属中的拷贝数测定

本文应用狭缝印渍杂交方法,把水稻基因组总DNA和含水稻中度重复顺序片段的质粒(pRRD9)DNA分别转移到尼龙膜上形成狭缝印渍、然后用³²P标记的 pRRD9插入片段进行杂交、根据各狭缝印渍的放射性强度,测定水稻(Oryza)一些栽培种和野生种基因组中重复DNA顺序的拷贝数,并就拷贝数与水稻进化关系及基因组型的联系进行讨论.     

DNA顺序测定中缺失子大小的快速鉴定

本文介绍了一种DNA顺序测定中缺失子大小的快速鉴定的方法。基本步骤是：用细胞裂解液裂 解被M13缺失子感染的细胞,离心取．上清直接电泳鉴定缺失子的RF DNA的相对大小,从而推侧缺 失的大小。     

水稻cDNA文库的构建以及100种随机挑取克隆部分结构的分析

以水稻 (Oryza sativa)“广陆矮 4号”黄化苗为材料 ,用 λZAP 为载体构建了 c DNA文库。对随机挑取的 1 0 0个 c DNA进行部分顺序测定后 ,与水稻和其它植物已知的基因结构作同源性比较分析 ,表明1 3%的 c DNA克隆可以确定功能 ,1 2 %的 c DNA克隆与其它植物中未知功能的基因片段有同源性 ,其余75%的克隆则表现出极少相似性或无任何同源性 ,从中可能发现新的基因。结果表明这个 c DNA文库适宜于进行大量顺序分析。由此将会获得更多功能性基因的信息。     

紫云英根瘤菌基因组中存在有类似IS因子的DNA重复顺序

在紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)的基因组中存在有DNA重复顺序(RSRa)。它在Ra159的基因组中重复4～5次,其中一个拷贝位于nifH基因的上游。以1.25kbPvul片段作探针,在其他紫云英根瘤菌菌株及豌豆根瘤菌RI PRE中也都检测到与RSRa同源的DNA片段。序列测定的结果表明RSRa其结构类似于IS因子,具有原核插入顺序的一些特点。RSRa全长1468bp,在RSRa的两个末端具有反向重复顺序,RSRa中有一个大的开放阅读框架(ORF)。由ORF推定的蛋白与大肠杆菌插入顺序IS903推定的转座酶有较高的同源性。     

弓形虫特异DNA片段顺序分析及体外基因扩增

从弓形虫(ZS_2株)基因组文库中筛选出了一个弓形虫特异DNA片段的克隆,对克隆的片段进行了部分顺序分析。根据所得DNA顺序,自行设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立了体外扩增弓形虫特异DNA顺序的聚合酶链反应(PCR)方法。4种不同来源的弓形虫株DNA、人工感染弓形虫的三头幼猪白细胞和胸腺DNA经过PCR扩增,均出现特异的扩增条带;而正常人、正常幼猪外围血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、溶组织内阿米巴和人巨细胞病毒DNA均不出现特异的扩增条带。对扩增产物进行了Southern印迹和限制性内切酶图谱分析,证明该PCR产物是弓形虫DNA特异的顺序。该方法可测出少至1pg的弓形虫DNA或1个弓形虫体的裂解液。本文分析的DNA顺序和设计合成的引物顺序数据,经电脑DNA数据库检索,证明无相同的顺序。本方法并具有简便、快速等优点,便于推广应用。     

大鼠肝含5~1端氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因的克隆

为研究氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS Ⅰ)基因表达的调控,我们根据CPS Ⅰ编码1—10氨基酸的mR NA顺序,合成一个30碱基的寡聚核苷酸。以它作为探针从大鼠肝基因库中筛选出一个阳性克隆,λ10。对其中4.5kb插入片断的内切酶谱及部分核苷酸序列测定证明它确含5′上游CPS Ⅰ基因DNA序列。     

水稻(Oryza sativa L.)重复DNA顺序的克隆及序列分析——重复顺序存在意义的探讨

以大肠杆菌启动子选择质粒pKK175-6、pKK232-8为载体,将通过复性动力学方法获得的水稻重复DNA顺序片段进行克隆。阳性克隆菌株表现出对四环素或氯霉素不同程度的抗性。DNA序列分析表明,克隆到的某些水稻重复DNA顺序具有丰富的基因表达调节元件的同源序列。     

真核细胞重复顺序DNA研究的一些进展

本文从如下几方面介绍了真核细胞重复顺序DNA结构功能研究的一些进展:(1)串联重复顺序是构成基因多态性的分子基础,基因多态性分析已用于家系分析;(2)一些短的重复顺序如LTR上具有转录调节信号,对基因表达起调控作用;(3)一些重复顺序的表达,与细胞生长分化有一定的相关性;(4)重复顺序在种属演化中具有一定的意义。     

一些水稻的重复DNA顺序在稻属和其它禾本科植物中的多态性

重复DNA顺序是真核生物基因组的特征,很多重复DNA顺序已从小麦、拟南芥菜、燕麦、水稻、玉米等植物的基因组中克隆出来,还发现有一些重复DNA顺序具有基因组特异性,用它们作探针可以分析同属或同科物种的起源和亲缘关系,并建立系统进化树。小卫星DNA或微小卫星DNA所产生的指纹图谱可作为一种遗传学标志来研究系统进化、染色体的精细结构和物种的鉴定。一些中度重复DNA序列还可以作为组织培养株系和细胞杂交筛选的分子标志。稻属已发现并定名的有22个种,根据杂交亲和性、细胞遗传学和生理生化等将它分为6个二倍体组型(AA、BB、CC、DD、EE和FF)和2个四倍体组型(BBCC和CCDD)。现多把禾本科分作5个亚科:竹亚科、稻亚科、早熟禾亚科、画眉草亚科和     

蓖麻蚕18S rRNA基因3′末端的顺序特征

本文测定了蓖麻蚕18S rRNA基因(rDNA) 3′末端及其外侧的DNA顺序。将这一顺序与家蚕、果蝇、大鼠 18S rDNA 3′末端顺序以及大肠杆菌16 S rDNA 3′末端顺序作了比较,发现它们间有惊人的同源性。不仅如此,这些基因的3′末端所形成的茎环结构也十分相似,在3′末端还有保守的EcoRI切点。这些研究结果对了解18S rRNA 3′末端在蛋白质合成中的功能及在rRNA前体加工成熟中的作用;对于了解rRNA基因的进化打下了基础。     

刺猬高重复顺序DNA的分子克隆及核苷酸顺序分析

为了分析比较食虫目高重复顺序的结构特征,我们将食虫目动物刺猬的高重复顺序DNA进行了分离、纯化、分子克隆,并测出了1186bp的核苷酸顺序。经分析发现在碱基组成上它与食虫目另一动物臭鼩有许多相似之处,如:G-C碱基对与A-T碱基对在整个片段中分布很不均衡;片段内部含有许多连续多次重复的短片段等,很可能为食虫目动物所特有。     

马槟榔甜味蛋白N-和C-末端部分氨基酸顺序的测定

从马槟榔(Capparis masaikai)种子中曾分离出二种甜味蛋白,称为Mabinlin Ⅰ和Ⅱ,分子量分别为11.6kD和10.4kD。用Edmail降解和反相HPLC鉴定PTH-aa方法测定证明:二者的N末端均因焦谷氨酸环化而封闭。采用1mol/l HCl-甲醇溶液35℃处理24小时的方法可使之开环。二种蛋白N端肽8个氨基酸残基顺序均为:Pyroglutamic acid-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Leu-Arg-。羧肽酶酶解的动态分析证明MaI羧端的氨基酸顺序为-Phe-Gln-Leu-Ala-Ser,MaⅡ为-Phe-Gln-Leu-Ala。其差别仅在于MaⅡ缺一个Ser,这一结果表明MaⅠ和MaⅡ的主要差异不是在端肽。     

稻瘟病菌重复顺序PoR6和稻瘟病菌的分型

POR6是一具有高度多态性的稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)重复顺序。利用脉冲电泳技术和Southern分析,表明它是非均匀地散布于基因组中的。经测定POR6的拷贝数约为30—40,序列测定未发现在内部有更小的重复单位。用POR6作探针对44株稻瘟病菌进行DNA指纹分析,分析的中国北方地区的22个菌株可根据相似率归并成8个谱系。对一些转管培养中致病型发生变化的菌株用POR6进行指纹分析,发现这些菌株在转管过程中基因组DNA是有变化的。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在酵母SUC2启动子-信号顺序控制下的表达

酵母SUC2基因克隆YFD6的DNA用核酸酶BAL31从SUC2基因的BamHI切点进行酶解,加上BamHI接头后,自连环化,得到的一个缺失质粒YFD6A21保留sucz基因动子-信号顺序以及氨基端22个氨基酸残基的编码顺序。将带有HBsAg基因的BamHI片段插入YFD6 A21的BamHI切点,使HBsAg基因suc2基因融合,然后将重担质粒引入酵母将酵母转化子在葡萄糖阻遏及去阻遏条件下生长,然后测定细胞内、周质空间和培养基中的HBsAg量。我们只能在葡萄糖去阻遏条件下检测到HBsAg的表达,几乎全部表达的HBsAg位于细胞内。